沙利霉素增强肝癌细胞对5-氟尿嘧啶敏感性及其作用机制研究＊

刘 鹏，黄美松，胡阳黔△

（1.湖北医药学院附属东风医院消化内科，湖北十堰442008；2.十堰市中西医结合医院内分泌科，湖北十堰442011）

原发性肝癌（HCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一，近几年的发病率呈上升趋势，其病因和发病机制尚未清楚[1]。HCC的耐药性是HCC晚期患者预后差和易复发的主要原因之一，因此，探索HCC耐药性机制和寻找有效治疗HCC的方法是研究人员最关心的问题之一。目前，有近100多种抗癌药物用于HCC的治疗，而化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）是治疗大多数早期癌症如结直肠癌[2]、乳腺癌[3]、食管癌[4]以及原发性肝癌[5]有效的抗癌药物。然而，由于中晚期癌症患者对5-FU的耐药性从而限制了其在临床上的应用，更为重要的是使用5-FU的患者容易对其他化疗药物产生耐药性[6-7]。

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）的发现提示为什么5-FU能有效治疗早期癌症患者，而对晚期癌症失效甚至对患者造成严重的不良反应[8-9]。研究认为5-FU能够靶向识别并抑制无限增殖和已分化的肝癌细胞，而对未分化的CSCs不起作用，提示CSCs是导致患者预后差和易复发最直接的原因[10]。最近，Gupta等[11]通过高通量筛选技术对16 000种抑制人乳腺癌CSCs的化合物进行筛选，发现只有沙利霉素（salinomycin，Sal）能选择性抑制乳腺癌CSCs的增殖。研究发现Sal能抑制骨肉瘤CSCs和子宫内膜CSCs的增殖[12-13]；近新研究证实Sal能抑制CD133＋阳性（干细胞生物标志物）肝癌细胞和胰腺癌细胞的增殖[14-15]。这些研究结果提示5-FU与Sal联合作用对处于不同阶段的癌细胞发挥抑制作用。因此，本文将5-FU与Sal联合作用研究这种联合作用是否能增加HCC对5-FU的敏感性从而杀死HCC干细胞，探讨HCC发生与发展的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H细胞（中科院上海细胞生物研究所）；5-FU和MTT（Sigma公司）；沙利霉素（宜昌永诺药业）；DMEM培养基（Gibco）、胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素（北京鼎国生物公司）；AnnexinV-FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒（成都艾特姆生物科技公司）；兔抗人CD133、EPCAM、p-GSK-3β-Tyr216、βactin抗体（Santa公司）；p-β-catenin抗体、β-catenin（Cell Signaling Technology公司）；辣根标记山羊抗兔IgG二抗购自中杉金桥公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HepG2，SMMC-7721和MHCC-97H细胞培养于含10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2及完全湿度的培养箱中。待细胞融合度达到80%左右时进行细胞传代。

1.2.2 细胞增殖抑制实验 将增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H细胞以4.5×104个／孔接种于96孔板中，每孔100μL，设置6个复孔，培养24h后弃掉培养基，各加入200 μL含不同终浓度5-FU（0、2、4、8、16μg／mL）和Sal（0、2、4、8、16μg／mL）的DMEM培养基，同时设置对照组（含DSMO的DMEM培养基），分别培养24、48、72h。后加入20μL 5mg／mL的MTT继续培养4h，弃上清液，加入150μL DMSO，振荡使结晶完全溶解，用酶标仪测定492nm处的吸光值（OD值）。重复3次，按公式（1）计算细胞增殖抑制率。

1.2.3 5-FU和Sal联合作用 将增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H细胞以细胞密度为4.5×104个／孔接种于96孔板中，每孔100μL，设置6个复孔，培养24h后弃掉培养基，分别混合交叉加入200μL含不同终浓度5-FU（0、2、4、8、16μg／mL）＋Sal（0、2、4、8、16μg／mL）的DMEM培养基，同时设置对照组（含DSMO的DMEM培养基），培养48h后运用MTT法测定每孔OD值。

1.2.4 克隆形成实验 将增殖期的HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H细胞离心收集后计数，以200个／皿接种于10cm细胞培养皿中培养24h；向培养皿中加入5-FU和Sal使其终浓度分别为8μg／mL和4μg／mL，同时设置对照组，培养12d，直到通过肉眼能清晰观察到可见的细胞克隆；将培养基倒掉，PBS洗涤，甲醇固定10min，PBS洗涤，吉姆萨染色10 min，自来水清洗，晾干后计数，按公式（2）计算细胞克隆形成率。

1.2.5 流式细胞实验 将增殖期的SMMC-7721细胞经消化后接种到6孔板中，培养24h后弃掉培养基，按下列实验因素作用细胞：PBS组，5-FU（8μg／mL），Sal（4μg／mL），5-FU（8 μg／mL）＋Sal（4μg／mL），作用48h后用PBS洗涤3次，消化离心收集细胞。按照Annexin-V／PI试剂盒说明书操作，先加入500μL的Binding buffer重悬细胞，再加入5μL FITC标记的Annexin-V和5μL PI混匀，室温下避光孵育15min，运用流式细胞仪测定细胞凋亡。将生长状态良好的SMMC-7721细胞经相同的方法分组处理后离心收集细胞，用藻红蛋白偶联的CD133抗体和FITC偶联的EPCAM抗体4℃孵育30min，同时以加入藻红蛋白偶联的鼠IgG作为对照。死细胞通过标记7-放线菌素D识别，运用流式细胞仪测定CD133（＋）-EPCAM（＋）阳性SMMC-7721细胞。

1.2.6 Western blot检测 将增殖期的SMMC-7721细胞经消化后接种到6孔板中，培养24h后弃掉培养基，按实验1.2.5方法处理细胞，作用48h后收集细胞。细胞经RIPA细胞裂解液提取总蛋白，按照BCA试剂盒测定蛋白浓度。将总蛋白50μg进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h，孵育一抗（p-GSK-3β-Tyr216，p-β-catenin，βcatenin和β-actin抗体），4℃过夜。洗膜、加入辣根过氧化物酶标记的二抗IgG（1∶2 000）室温孵育1h。照片经ECL后扫描，蛋白表达灰度值经Quanity-One软件分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据分析，结果用均数±标准误差（mean±SEM）表示。组间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。方差分析后的成对比较采用S-N-K分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-FU和Sal抑制肝癌细胞的增殖 5-FU和Sal均能抑制肝癌细胞的增殖，细胞抑制率与浓度呈时间-剂量依赖效应，见图1。相同条件下，Sal对肝癌细胞的抑制作用大于5-FU对肝癌细胞的抑制作用，当5-FU和Sal浓度分别为8μg／mL和4μg／mL时细胞抑制率达到最大，5-FU和Sal对SMMC-7721细胞的抑制作用大于HepG2和MHCC-97H细胞。因此，在细胞凋亡实验和机制研究中以SMMC-7721细胞为研究对象。

图1 MTT法测定5-FU和Sal对肝癌细胞增殖的影响

表15 -FU与Sal联合作用对HepG2细胞增殖的影响（±s）

表15 -FU与Sal联合作用对HepG2细胞增殖的影响（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.248±0.035 0.312±0.006 0.348±0.023 0.471±0.021 2 0.319±0.025 0.446±0.078 0.523±0.018 0.541±0.091 0.583±0.033 4 0.412±0.081 0.519±0.062 0.562±0.091 0.633±0.048 0.715±0.042 8 0.513±0.059 0.573±0.088 0.611±0.102 0.682±0.055 0.748±0.072 16 0.588±0.042 0.650±0.079 0.739±0.083 0.783±0.031 0.899±0.038

表2 5-FU与Sal联合作用对SMMC-7721细胞增殖的影响（±s）

表2 5-FU与Sal联合作用对SMMC-7721细胞增殖的影响（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.300±0.034 0.394±0.016 0.431±0.045 0.498±0.011 2 0.368±0.022 0.476±0.066 0.583±0.065 0.562±0.085 0.611±0.067 4 0.472±0.063 0.587±0.054 0.605±0.077 0.671±0.044 0.775±0.009 8 0.549±0.021 0.598±0.021 0.641±0.062 0.702±0.035 0.808±0.058 16 0.602±0.044 0.682±0.032 0.782±0.073 0.795±0.062 0.914±0.073

表3 5-FU与Sal联合作用对MHCC-97H细胞增殖的影响（±s）

表3 5-FU与Sal联合作用对MHCC-97H细胞增殖的影响（±s）

5-FU（μg／mL）Sal（μg／mL）0 2 4 8 16 0 0 0.285±0.088 0.361±0.022 0.415±0.055 0.444±0.063 2 0.341±0.015 0.442±0.047 0.548±0.079 0.541±0.089 0.591±0.059 4 0.428±0.033 0.538±0.081 0.585±0.041 0.649±0.081 0.682±0.029 8 0.505±0.063 0.567±0.034 0.602±0.064 0.684±0.077 0.778±0.066 16 0.582±0.058 0.665±0.051 0.713±0.057 0.735±0.041 0.854±0.091

2.2 5-FU和Sal联合作用对肝癌细胞增殖的影响 MTT结果显示5-FU和Sal联合作用肝癌细胞48h后，细胞抑制率明显高于5-FU或Sal单独作用肝癌细胞时的抑制率，并且随着5-FU或（和）Sal浓度的增加，这种协同作用越强。结果显示，SMMC-7721细胞对5-FU和Sal协同作用的敏感性大于HepG2和MHCC-97H细胞，提示5-FU和Sal协同作用对不同的癌细胞存在差异性（表1～3）。结果证实，5-FU和Sal对肝癌细胞增殖抑制具有协同作用，且对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用最强。

2.3 5-FU和Sal协同作用抑制肝癌细胞克隆形成 5-FU（8 μg／mL）、Sal（4μg／mL）和5-FU（8μg／mL）＋Sal（4μg／mL）分别作用HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H细胞48h后，肝癌细胞增殖能力被显著抑制（P＜0.01）。当5-FU＋Sal共同作用肝癌细胞时表现出协同作用，肝癌细胞的克隆数显著低于5-FU或Sal单独作用细胞时的克隆数，见图2。

2.4 5-FU和Sal联合作用对SMMC-7721细胞凋亡的影响 MTT和克隆形成实验结果已表明，5-FU和Sal对HepG2、SMMC-7721和MHCC-97H细胞的增殖抑制具有协同作用，而且这一作用对SMMC-7721细胞最为明显。而流式细胞术检测5-FU和Sal对SMMC-7721细胞凋亡结果如图3显示，5-FU和Sal浓度为8μg／mL和4μg／mL时，SMMC-7721细胞凋亡率分别为（18.52±3.45）%和（20.64±2.15）%；当二者联合作用时，SMMC-7721细胞凋亡率达到（27.93±3.56）%，明显高于二者单独作用时的细胞凋亡率。

图2 5-FU和Sal联合作用对肝癌细胞单克隆形成的影响

2.5 5-FU和Sal联合作用对肝癌细胞SMMC-7721肿瘤干细胞的影响 利用流式细胞仪测定SMMC-7721细胞经5-FU、Sal、5-FU和Sal作用48h后CD133（＋）-EPCAM（＋）阳性SMMC-7721细胞水平，发现SMMC-7721细胞经5-FU作用48h后CD133（＋）-EPCAM（＋）细胞数量从（28.5±3.71）%增加到（47.9±4.33）%（P＜0.01）；而细胞经Sal作用后CD133（＋）-EPCAM（＋）细胞数量显著降低，从（28.5±3.71）%降低到（15.7±2.15）%（P＜0.01）。当5-FU和Sal联合作用细胞后CD133（＋）-EPCAM（＋）阳性SMMC-7721细胞数与5-FU单独作用时的细胞数比显著降低，从（47.9± 4.33）%降低到（31.47±5.26）%，（P＜0.01），见图4。

图3 流式细胞仪检测5-FU和Sal对SMMC-7721细胞凋亡的影响

图4 5-FU和Sal对SMMC-7721肿瘤干细胞增殖的影响

2.6 Sal能抑制Wnt／β-catenin信号通路 研究证实Wnt／βcatenin信号通路参与致瘤性肝脏祖细胞活性的调节，外在作用下激活肝脏祖细胞转化为肝癌细胞[17-18]。Western-blot检测结果如图5所示，与5-FU处理组比较，Sal和联合作用组细胞中p-GSK-3β（Tyr216）蛋白表达量显著增加；p-β-catenin蛋白表达量在Sal处理组细胞中明显升高，当二者联合作用时降低。

图5 Western-blot检测5-FU和Sal对SMMC-7721细Wnt／β-catenin信号通路蛋白表达影响

3 讨论

在HCC患者中，仅有30%～40%患者符合根治性治疗，这些治疗手段包括手术切除，肝移植以及肝动脉栓塞化疗，大多数患者希望通过化疗来延长生命。最新数据显示HCC肿瘤干细胞对化疗药物（例如5-FU）表现出抗药性。研究表明，EPCAM和CD133蛋白是肝癌细胞Huh7中肿瘤干细胞膜表面的生物标志物[16]。以抑制肿瘤干细胞增殖为出发点用作临床治疗还面临诸多挑战，因为在杀死癌细胞和肿瘤干细胞的时候可能需要多种药物联合作用。Sal是一种抗生素，能杀灭细菌，霉菌和寄生微生物，最新的研究表明，Sal能选择性杀死乳腺癌肿瘤干细胞[12]和结肠癌肿瘤干细胞[19]。研究发现Sal能抑制HCC细胞中CD133阳性细胞的增殖[15]。考虑到Sal这一独特功能，本文以3种人肝癌细胞株为研究对象研究5-FU和Sal素联合作用能否提高HCC细胞对5-FU的敏感性。

本研究探讨了Sal能否降低肝癌细胞对5-FU的抗药性。CD133和EPCAM蛋白是一种膜蛋白，在肝癌细胞中被视为肿瘤干细胞生物标志物[20-21]。研究发现在肝癌细胞Huh7细胞中存在CD133（＋）-EpCAM（＋）阳性细胞[22]。本研究显示5-FU和Sal联合作用后CD133（＋）-EpCAM（＋）阳性细胞数量显著降低，而5-FU单独作用后CD133（＋）-EpCAM（＋）阳性细胞数量明显增加；克隆形成实验结果显示二者联合作用显著抑制肝癌细胞的克隆形成。这一作用可能的原因是5-FU和Sal联合作用抑制肝癌细胞中CD133（＋）-EpCAM（＋）阳性细胞的增殖，提示通过Sal抑制肝癌细胞肿瘤干细胞的增殖来提高HCC细胞对5-FU的敏感性。研究证实Wnt／β-catenin信号通路的激活或抑制与癌细胞抗药性密切相关[23]；Wnt／βcatenin信号通路在维持干细胞处于未分化状态方面起着重要作用[24]。β-catenin蛋白是Wnt／β-catenin信号通路中的重要组成部分，而Gsk-3β蛋白是β-catenin基因的上游调控因子，在外界条件的刺激下Gsk-3β蛋白与β-catenin蛋白结合进而使其发生磷酸化而降解。经典的Wnt信号通路由β-catenin蛋白介导，激活型β-catenin蛋白核转移的积累可促进肝癌细胞对5-FU的抗药性。本研究发现Sal、5-FU＋Sal分别作用肝癌细胞后细胞通过上调β-GSK-3β（Tyr216）的表达抑制激活型β-catenin蛋白的表达，提示5-FU可抑制Wnt／β-catenin信号通路，而Sal和5-FU联合作用可使这一功能得以恢复。

本研究发现Sal通过抑制HCC细胞中肿瘤干细胞的增殖来提高HCC细胞对5-FU的敏感性。由此推测，除了5-FU之外，仍有大量的化疗药物可能通过促进肿瘤干细胞增殖的途径使其对癌细胞治疗失去作用。本研究为临床对化疗药物失敏的HCC患者提供了新的治疗方案。

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