宫颈癌全外显组测定及易感基因研究＊

胡 蓉，钟田雨，陈晓红

（赣南医学院第一附属医院检验科，江西赣州341000）

宫颈癌是一种在妇女中多发的恶性肿瘤疾病，其病死率、发病率仅次于乳腺癌，发病年龄越来越趋于年轻[1]。发展中国家宫颈癌的发病率较高，我国宫颈癌患者约占全球总患者的1／3，且发病年龄年轻化，对女性的生命健康造成严重威胁，必须引起重视。人乳头瘤病毒（HPV）感染一直被公认为是导致宫颈癌发病的病因[2-3]，这种病毒的感染引发宫颈发生癌前病变，最终引发为宫颈癌。感染HPV妇女主要集中在青年和中年女性，但其中只有很少的妇女会发展为癌症，并且感染的过程需要较长的时间，如果做好预防措施，治愈的可能性很大，因此单独的HPV感染可能不是导致宫颈癌的主要病因。随着对基因研究的不断深入，特别是对基因多态性的研究发现，在HPV感染发展到宫颈癌的过程中，基因的多态性可能起到很大的作用，本研究通过对128例宫颈癌妇女与100例健康妇女微小RNA-96（MiR-96）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、Twist与Slug基因表达水平的对比分析，评估其表达对宫颈癌发病的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年3月至2014年5月在本院就诊的宫颈癌患者128例，为观察组。其中鳞癌110例（85.9%），腺癌10例（7.8%），腺鳞癌8例（6.3%），年龄22～67岁，平均（45.0±3.4）岁，手术之前均未接受化疗或者放疗。同时收集同期进行常规体检的健康者100例作为对照组，对照组各项化验指标正常并且无肿瘤史。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 HIF-1α表达检测 采用HIF-1α试剂盒（苏州普泰生物技术有限公司）对单克隆抗体HIF-1α进行检测，按照试剂盒要求进行染色及组织标本制备，用显微镜对制备组织进行观察，计数阳性染色细胞数。根据肿瘤细胞染色强度及显色比例，计算阳性细胞率，大于10%为阳性。

1.2.2 MiR-96表达检测 将组织标本切成薄片，再研磨成粉末，用Trizol试剂按照Trizol试剂盒（Invitrogen公司）的说明提取总RNA，将RNA进行反转录，通过PCR定量检测MiR-96的相对表达值，其正向引物：5′-TTT GGC ACT AGC ACA TT-3′；反向引物：5′-TTT GGC ACT AGC ACA TT-3′。引物序列长度肿瘤的分期是按照WHO以及国际妇产科协会（FIGO）的肿瘤分期标准。MiR-96表达以U6参数，测得到△Ct值，△Ct＝MiR-96平均Ct值-U6平均Ct值，而2-△△Ct就可以反应MiR-96的相对表达情况。

1.2.3Twist与Slug基因表达检测 将组织标本切成薄片，再研磨成粉末，Trizol试剂盒（Invitrogen公司）提取组织RNA，根据Twist与Slug基因的序列编号来进行引物的设计，Twist上游引物序列：5′-ACG AGC TGG ACT CCA AGA TG-3′，下游引物序列：5′-GGC ACG ACC TCT TGA GAA TG-3′；Slug上游引物序列：5′-CCT GGT TGC TTC AAG GAC AC-3′，下游引物序列：5′-TCC ATG CTC TTG CAG CTC TC-3′，通过PCR定量检测Twist与SlugmRNA的相对表达值。TwistmRNA相对表达水平＝Twist拷贝数／β-actin拷贝数，SlugmRNA相对表达水平＝Slug拷贝数／β-actin拷贝数。

表1 HIF-1α在两组妇女宫颈组织中的表达结果[n（%）]

1.3 统计学处理 采用数据处理软件包为SPSS16.0，计量资料符合正态分布、方差齐性的数据用±s表示，组间比较采用t检验，计数资料用率表示，组间采用χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α在两组妇女宫颈组织中的表达 HIF-1α在肿瘤组织中的阳性表达率为75.8%，在正常组织中的表达率为0%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），详细见表1。

2.2 MiR-96在两组妇女宫颈组织中的相对表达值 MiR-96在正常组织的相对表达值为1.01±0.16，在肿瘤组织中为44.56±3.67，在肿瘤组织中的相对表达值远远高于正常组织，两组进行比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；肿瘤组织Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期MiR-96相对表达值分别为15.43±2.01、84.42±7.65、456.32±37.32，两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3Twist与Slug基因在两组妇女宫颈组织中的表达Twist基因在正常组织的相对表达量为（2.02±0.46）×10-3，在肿瘤组织中为（6.54±1.23）×10-3，在肿瘤组织中的相对表达量远远高于正常组织，两组进行比较差异有统计学意义（t＝38.29，P＜0.05）；Slug基因在正常组织的相对表达量为（1.32±0.34）×10-2，在肿瘤组织中为（4.68±1.02）×10-2，在肿瘤组织中的相对表达量远远高于正常组织，两组比较，差异有统计学意义（t＝34.87，P＜0.05）。

3 讨论

宫颈癌是一种在中老年妇女中高发的癌症疾病，发生率有逐年上升的趋势。HPV病毒感染一直以来被公认为是导致宫颈癌的主要因素，针对此类病毒的疫苗研制取得了重大进展[4]。但随着人们对宫颈癌疾病研究的不断深入，发现只有少数的病毒感染者会最终发展为宫颈癌，提示宫颈癌的发生除了HPV感染导致以外，环境致癌因素与遗传因素也可能是导致宫颈癌发生的主要因素。遗传因素并不直接导致肿瘤的发生，但它会改变个体的易感性，并且在特殊的条件下被激发。

大量研究报道，MiR-96[5]、HIF-1α[6]、Twist与Slug基因表达升高可使患宫颈癌的概率大大提高，宫颈癌发生与上述基因的表达有很大的关系[7]。MiR-96可能通过调控参与基因的信号通路，从而导致癌细胞的侵袭能力增强，在这个过程当中MiR-96发挥了与癌基因类似的功能，间接参与了宫颈癌的发生[8]；Twist与Slug基因，对宫颈癌的发生、侵袭，甚至耐药都有着很大影响，它们的过度表达与乳腺癌、卵巢癌、胃癌等肿瘤的发生、发展关系密切[9]。HIF-1α在肿瘤的发生中起着不可忽视的作用[10]。肿瘤细胞的快速生长势必会造成肿瘤组织缺氧，HIF-1α在应付组织缺氧方面起着重大作用[11-12]，缺氧情况下HIF-1α上调，引起多血管的形成[13-14]，细胞适应缺氧的环境导致肿瘤细胞的继续生长、扩散[15]。本研究通过对MiR-96、HIF-1α、Twist与Slug等易感基因在宫颈癌组织及正常组织中的表达水平测定，结果显示：HIF-1α在正常组织中基本没有阳性表达，而在肿瘤组织中阳性表达率远远高于正常组织；MiR-96在肿瘤组织中的相对表达值远远高于正常组织，并且随着疾病的进展表达量显著提高；Twist与Slug基因在肿瘤组织中的相对表达量远远高于正常组织；两组进行比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，MiR-96、HIF-1α、Twist与Slug等易感基因均与肿瘤的发生有关，甚至可能是导致宫颈癌发生的重要因素。有必要对上述基因进行进一步的研究，为临床妇科肿瘤的诊断、治疗提供一定的科学依据。

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