干细胞在发育毒性体外模型建立中的应用研究进展

贾源君 裴轶劲广东医学院生理学教研室 干细胞与再生医学研究所，广东东莞 523808

干细胞在发育毒性体外模型建立中的应用研究进展

贾源君 裴轶劲▲
广东医学院生理学教研室 干细胞与再生医学研究所，广东东莞 523808

干细胞是一种原始细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能。目前，由于环境和药物等外在因素的影响，畸形新生儿的比例逐年升高，建立准确、便捷、高效的发育毒性体外模型来评价预测各种化合物的发育毒性是亟待解决的难点问题。应用各类干细胞预测外在因素对机体的发育毒性，其优势远大于其他检测毒性方法。本文就近年来基于干细胞建立发育毒性体外模型的研究进行综述。

干细胞；发育毒性；体外模型；胚胎干细胞

在发育毒性的预测和评价中，一直存在着无法精确地用动物试验结果预测外源物在人体上使用的安全性的难点问题。2013年美国的一项调查研究中表明，每年美国有超过120 000名婴儿出生时有致命的先天缺陷,是婴儿死亡率的主要原因［1］。由于全球的环境日益恶化以及每年大量新化合物的产生，对自然生态平衡和人类健康存在具大潜在影响，所以毒性筛选显得日益重要。发育毒性体外模型成为研究预测外源物质的发育毒性的良好工具。干细胞在发育毒性体外模型建立中不断应用，尤其是近年来胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS细胞）的发现，使发育毒性的研究更为深入。本文就近年来最新相关研究进行综述。

1 干细胞研究概述

干细胞按发育阶段分为成体干细胞（somatic stem cell）和ES细胞。按发育潜能又分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞（专能干细胞）。

成体干细胞是出生后遗留在机体各种组织器官内的干细胞，它可以在未成熟的状态增殖，具有分化成有限数量的细胞类型潜力，并具有可塑性。它研究起始于20世纪60年代，是21世纪一个伟大的科学发现。

胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）内细胞团或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在一定条件下，ES细胞能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。1981年Evans等［2］与Martin［3］分别成功分离和建立了小鼠的ES细胞系，这是ES细胞领域动物实验的里程碑。直到1998年美国Thomson等［4］和Gearhart［5］分别从人胚胎和胎儿生殖嵴中建立了人类ES细胞，被当年的科学杂志称为十大重大科学发现之一。Suda等［6］将小鼠ES细胞传250代以上,发现仍具有正常的二倍体核型，也没有出现转化的迹象，可以产生正常的配子，作为核供体能重组克隆胚胎，从而证明了小鼠ES细胞具有永生性。

2006年，日本科学家发现将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的基因导入小鼠成纤维细胞，产生了与胚胎干细胞具有相似特性的细胞称之为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）［7］。2007年，两个研究小组分别将人的体细胞重编程为人iPS细胞［8-9］。

这些研究成果的问世在生命科学领域引起轰动，在干细胞研究历史上具有划时代的意义，被誉为生命科学领域新的里程碑，干细胞研究进入了一个崭新的阶段。

2 关于发育毒性的概述

从受精卵到性成熟的青春期一直到衰老都属于发育过程。发育毒性是发育毒理学研究的重要内容之一。发育毒性主要表现：发育生物体死亡、生长改变、结构异常和功能缺陷。

一般的胚胎发育毒性检测很大程度上依赖方法替代或补充传统的动物实验［10］。但这些试验需要大量动物，模型建立困难、影响因素多、费用高、试验周期长，难以迅速对大量物质进行毒性评价等问题。相比之下，体外试验有简便、经济、周期短、试验条件可控、剂量-反应关系易测等优点，现已广泛应用于发育毒性的筛选和致畸机制的研究。

与其他毒理学体外试验相比，体外毒性试验一般通过对正常增殖的原代细胞或者永生化细胞而获得的。但是这些细胞有的来源短缺，变异性大，有的生物学特性已经异化。而且这些细胞没有涵盖早期胚胎阶段到最终分化成特定细胞的全过程，受试物产生的细胞毒性与胚胎毒性是有差别的，使得发育毒性试验筛选的发展和完善受到阴碍。而干细胞具有的全能分化等特性，并且可以提供大量的细胞进行高通量测定法，是药物研发及安全性评价的良好的体外替代模型［11］。

3 各种类型干细胞在发育毒性发面的研究

细胞毒性试验广泛应用对细胞破坏性影响的试验物质。在候选药物对各种细胞的药理作用和毒性试验中，干细胞及其衍生物成为研究受试物的细胞毒性体外替代实验模型。目前以干细胞为基础的毒理实验分为以下三类；①通过测定活细胞数和细胞的存活率来评价急性毒性（细胞毒性分析）；②对干细胞分化成其他类型的细胞（发育毒性试验）评估其抑制作用；③分析确定从干细胞分化的成熟细胞的细胞功能的抑制或刺激作用（细胞功能测定）［12］。

发育毒性试验被用来评估暴露于试验材料中干细胞异常分化的风险。在胎儿发育过程中，未成熟的干细胞分化异常可导致发育异常和肿瘤发生。在发育毒性研究过程中，不仅要研究细胞的毒性，还要研究胚胎的发育毒性。

3.1 胚胎干细胞

近来应用干细胞建立胚胎发育毒性体外模型研究最热的是ES细胞。小鼠ES细胞建立出以来，研究者纷纷利用ES细胞的特性，从细胞毒性、分化抑制和基因表达等不同水平研究胚胎发育毒性，显示了其良好的应用前景。20世纪90年代末，欧洲替代方法研究中心（ECVAM）推荐有效性较高的三个体外胚胎发育毒性筛选试验作为体外筛选的首选方法，其中之一即为胚胎干细胞试验（embryonic stem cell test，EST），是以小鼠ES细胞的细胞毒性和分化抑制为终点的体外胚胎毒性筛检试验。ECVAM挑选出已明确体内胚胎发育毒性等级的30种受试物，使用EST进行胚胎发育毒性检测，结果显示与体内结论的符合率达到82%，其中强胚胎毒性的符合率更达到100%［13］。

2004年，Zur Nieden等［14］采用了多分子终点的EST，全面评估了胚胎发育毒性中的各个终点情况。多分子终点法是胚胎发育毒性实验模型建立继形态终点法的进一步突破。之后Buesen等［15］结合流式细胞仪形成了一种新的方法，并将预测终点提前到了分化第7天，并且更为灵敏。目前，还有在经典EST方法上结合蛋白表达检测技术或基因芯片技术，目的是使预测更为灵敏、快捷。

经典EST将心肌细胞作为ES细胞分化发育的衡量指标［16］。2012年，van Thriel等［17］人在实验过程中发现，单将抑制心肌细胞分化水平作为试验检测终点，尚不能全面反映受试物的发育毒性作用。因为大多数的致畸物还可引起骨骼畸形或中枢神经系统功能异常等现象。早在1995年，Bain等［18］建立的经视黄酸诱导ES细胞神经分化方法，现被认为是最基本的,也是最经典的神经细胞诱导方法。之后有研究者将胚胎干细胞诱导为神经细胞等来继续检测药物的发育毒性［19］。还有学者检测化合物对胚胎干细胞诱导分化为成骨细胞、肝细胞等的抑制作用，尝试全面的反映受试物的发育毒性作用［20-21］。

人类ES细胞，与小鼠ES细胞相比，毫无疑问其在外源物胚胎毒性和致畸性检测中将有更重要的研究前景和应用价值，也有一些学者做过相关实验。但因存在伦理道德问题，引起很大争议。人类ES细胞在胚胎发育毒性模型建立方面与鼠ES细胞方法基本一致，近期陆续有报道［22］。

3.2 诱导多能干细胞

iPS细胞的应用价值在于获得方法相对简单和稳定，在技术上和伦理上更有优势，具有广泛的临床应用价值。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、标志物表达等方面与ES细胞非常相似,而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同［23-24］，可作为一种新的测试发育毒性模型检测。

目前，人类iPS细胞的胚胎发育毒性模型研究还鲜有报道。在2014年，日本科学家Aikawa等［25］用人类iPS细胞检测沙利度胺细胞毒性和胚胎毒性，达到了预期的结果。但他的实验只是针对目的药物的毒性，尚需深入和全面验证试验方法的可靠性。

3.3 成体干细胞

与ES细胞相比，成体干细胞从患者身上直接分离干细胞，进行体外大量增殖。诱导它们分化为所需细胞类别，不涉及法律限制和伦理道德范畴，是理想的医学临床治疗和研究的来源。但是存在于机体内的各种干细胞数量较少，离体的成体干细胞群通常不稳定，扩增时间长，并且成体干细胞的记忆功能，会朝向原始细胞分化等因素，所以在建立发育毒性模型时受到限制。

3.3.1 神经干细胞（neural stem cell，NSC）NSC的研究起步较晚，在神经发育毒性（developmental neurotoxicity，DNT）方面起着重要作用。由于神经发育毒性体内试验周期长，代价高，所以体外替代有非常重要的意义。20世纪90年代初，Johnasson等［26］利用逆转录病毒标记法证明成年哺乳动物的脑室管膜含有大量的持续增殖的细胞，即NSC。用于神经发育毒性研究的神经干细胞来源主要有：胚胎脑组织来源的神经干细胞，胚胎干细胞源性神经干细胞，人脐带血源性神经干细胞等［27］。神经干细胞在判断药效及药物毒性等有一定实用价值［28］。NSC增殖、迁移和分化的异常至少可以为神经系统发育异常提供基本线索，因此，NSC已成为研究外源化学物神经发育毒性的比较理想的体外模型［29-30］。但是由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。

3.3.2 骨髓间充质干细胞 间充质干细胞（mesenchy mal stem cells，MSC），是一种多分化潜能的成体干细胞，最初在骨髓中发现。能发育成骨、软骨、肌肉、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。骨髓间充质干细胞（Bonemesenchymal stem cell，BMSC）因具有多向分化潜能、易于分离培养以及不涉及伦理道德等优势，其相关研究近年来兴起并得到快速发展。研究表明将BMSC在体外诱导培养4个月获得永生化的心肌细胞系［31］。BMSCs体外在生物化学因素的诱导下可以向心肌细胞分化，所以可采用与经典EST相同的步骤来检测胚胎发育毒性测试。不足之处是，但骨髓间充质干细胞经过分选后增殖缓慢，而且获取来源数量有限，在某种程度上限制了它的发展。

4 问题和展望

应用干细胞尤其是全能干细胞来评价和预测发育毒性的研究仍然存在很多未知的难题。由于现有的技术和条件的限制，从理论上讲，例如ES细胞、iPS细胞等在体外培养的条件不可能完全模拟体内的生长条件，其体外分化通路和机制也难以完全相同于体内胚胎细胞的发育［32］。iPS细胞还存在转化率低、安全性、具有来源体细胞的记忆影响分化方向等问题。在以iPS细胞建立胚胎发育毒性模型方面，由于诱导条件还未成熟，给建模带来很大的难度。

虽然现阶段iPS细胞还不能完全取代传统胚胎干细胞研究发育毒性，技术也存在一些有待解决的问题，但iPS细胞的研究无疑会成为发育毒性领域的一个重要方向。通过流式技术，细胞集落分析，基因表达，和荧光显微分析等可灵敏的用于毒物筛选，未来发育毒性研究和预测的将更加高效能服务人类。

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Current research in establishing in vitro model of developmental toxicity based on stem cells

JIA Yuanjun PEI Yijin▲
Department of Physiology Institute of Stem Cell and Regenerative Medicine,Guangdong Medical College,Guangdong Province,Dongguan 523808,China

Stem cells are the original cells with multi-potency and self-renewal capability.Recently,due to the adverse effects of environmental and external factors such as drugs,the ratio of deformed newborns increased year by year.It is a difficult problem to be solved,which establishing the accurate,convenient,efficient in vitro model of developmental toxicity to evaluate and predict developmental toxicity of various compounds.Kinds of stem cells were applied to evaluate and predict the development toxicity of external factors on the body,which have far more advantages than other toxicity tests.This article reviewed the recent research about in vitro models of developmental toxicity based on various stem cells.

Stem cells;Developmental toxicity;In vitro model;Embryonic stem cell

R394.1；R994

A

1673-7210(2015)01(b)-0152-04

2014-10-14本文编辑：苏 畅）

国家自然科学基金项目（81173136）；广东省科技计划项目（2013B022000003）；广东省东莞市科技计划项目（2012108102057）。

贾源君（1990.10-），女，广东医学院2012级生理学专业在读硕士研究生；研究方向：干细胞与发育毒性。

▲通讯作者