膜联蛋白Ⅱ在乳腺癌组织中的表达以及对乳腺癌细胞侵袭的影响

余文杰　沈孝坤

[摘要] 目的 探讨膜联蛋白Ⅱ在乳腺癌中的表达以及对乳腺癌细胞侵袭的影响。 方法 分别采用免疫组化方法检测AnnexinⅡ蛋白在正常乳腺组织、导管原位癌以及侵袭性导管癌组织中的表达情况，并测定高侵袭性乳腺癌细胞株及低侵袭性乳腺癌细胞株中AnnexinⅡ mRNA（RT-PCR法）以及蛋白（蛋白印记技术）的表达情况。 结果 AnnexinⅡ在正常乳腺组织中主要表达在间质内，在乳腺导管上不表达，在导管原位癌以及侵袭性导管癌组织中间质、血管、肿瘤组织上均有表达。AnnexinⅡ在正常乳腺组织表达的IOD值为（6.5±1.0）×106，在导管原位癌中表达的IOD值为（27.5±3.0）×106，在侵袭性导管癌组织中表达的IOD值为（40.0±11.0）×106。三组间比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），导管原位癌、侵袭性导管癌组织中的表达量显著高于正常乳腺组织，而侵袭性导管癌中的表达量显著高于导管原位癌（均P < 0.01）。AnnexinⅡ mRNA在高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s中的表达灰度值（0.83±0.11）显著高于MCF-7株中的表达（0.07±0.01），差异有高度统计学意义（P < 0.01）；AnnexinⅡ蛋白在高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s中的表达（1.47±0.08）显著高于MCF-7株中的表达（0.11±0.03），差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 AnnexinⅡ在乳腺癌中高表达，并且瘤细胞侵袭性越强，其表达也越强。

[关键词] 乳腺癌；增殖；膜联蛋白Ⅱ

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）01（b）-0004-04

[Abstract] Objective To discuss expression of Annexin Ⅱ in breast cancer and the effects on the invasion of breast cancer cells. Methods Annexin Ⅱ expression in normal breast tissue， ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma tissues were detected by immunohistochemical method， and Annexin Ⅱ mRNA （RT-PCR） and protein （Western blot） expressions in high invasive breast cancer cell lines and low invasive breast cancer cell lines were detected. Results In normal breast tissue， Annexin Ⅱ was mainly detected in troma， without expression on breast catheter. In ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma tissues， Annexin Ⅱ was detected in troma， vessel and tumor tissue. IOD of Annexin Ⅱ expression in normal breast tissue was （6.5±1.0）×106， in ductal carcinoma was （27.5±3.0）×106， and in invasive ductal carcinoma tissues was （40.0±11.0）×106. There was significant difference in three groups （P < 0.01）. IOD of Annexin Ⅱ expression in invasive ductal carcinoma tissues and ductal carcinoma was higher than that in normal breast tissue， and IOD of Annexin Ⅱ expression in invasive ductal carcinoma tissues was higher than that in ductal carcinoma （all P < 0.01）. Gray value of AnnexinⅡ mRNA expression in high invasive breast cancer cell lines MDA-MB-435s was （0.83±0.11）， which was higher than that in low invasive breast cancer cell lines MCF-7 （0.07±0.01）， and there was significant difference between two cell lines （P < 0.01）. IOD of AnnexinⅡ protein expression in high invasive breast cancer cell lines MDA-MB-435s was （1.47±0.08）， which was higher than that in low invasive breast cancer cell lines MCF-7 （0.11±0.03）， and there was significant difference between two cell lines （P < 0.01）. Conclusion Annexin Ⅱ shows high expression in breast cancer， and the stronger aggressive of tumor cells is， the higher expression of it is.

[Key words] Breast cancer； Multiplication； Annexin Ⅱ

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，近年来乳腺癌的发病率有上升的趋势。膜联蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）是一种磷脂结合蛋白，具有钙离子依赖性，主要以单体、二聚体和四聚体的形式存在，四聚体是2个AnnexinⅡ蛋白单体与2个s100A10（P11）单体组成[1-3]。AnnexinⅡ和s100A10组成的四聚体只存在于细胞质和细胞膜，而细胞核中AnnexinⅡ以单体形式存在。AnnexinⅡ参与细胞的分泌、增殖、细胞骨架连接等生物学功能，还能直接结合到原癌基因（c-myc）mRNA上，上调c-Myc蛋白[4-6]。研究显示AnnexinⅡ在多种肿瘤中有过表达，并在肿瘤的发生发展、浸润转移过程中发挥重要的作用[7-8]。本研究通过比较正常乳腺组织、导管原位癌以及侵袭性导管癌中AnnexinⅡ水平，分析AnnexinⅡ在乳腺癌组织中的表达情况，通过比较高侵袭性乳腺癌细胞株及低侵袭性乳腺癌细胞株中AnnexinⅡ的表达情况，分析AnnexinⅡ在乳腺癌侵袭及转移过程中的作用。现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 组织标本及细胞株

正常乳腺组织以及乳腺癌组织均由浙江省台州医院病理室提供。人乳腺癌细胞株包括高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s株和低侵袭性人乳腺癌细胞株MCF-7，购自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

小鼠抗人AnnexinⅡ单克隆抗体，小鼠抗人β-actin单克隆抗体，FITC标记的兔抗上样IgG，由美国Santa Cruz公司提供；辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG，辣根过氧化酶标记的兔抗羊IgG，TRITC标记的山羊抗小鼠IgG，SP免疫组化试剂盒，由上海鑫乐生物科技有限公司提供。细胞培养箱，双垂直板蛋白电泳槽，电泳仪，凝胶数字成像系统。

1.3 实验方法

1.3.1 AnnexinⅡ在正常乳腺组织、乳腺癌组织中的表达 采用免疫组织化学法进行检测。标本脱蜡，加入3% H2O2浸泡，去除内源性过氧化氢酶，清水冲洗2次，加入0.01 mol/L的柠檬酸，蒸煮3 min，冷却后再蒸煮1次，冷却，抗原修复。水洗2次后将载玻片放置于PBS液中5 min洗2次，擦干，加正常山羊/兔血清封闭，37℃温箱中放置30 min。加一抗，4℃保存过夜，置于37℃下复温后在PBS液中冲洗5 min，3次，加二抗，37℃温箱中放置20 min。PBS冲洗5 min，3次，加SABC，37℃温箱内放置30 min。PBS液冲洗5 min，3次，加DAB显色液。清水冲洗后浸泡入苏木精复染1 min。脱水，封片。在显微镜下观察图像，并采用软件分析染成黄色区域的累积光密度（IOD）值。

1.3.2 AnnexinⅡ mRNA以及蛋白在高侵袭人乳腺癌细胞株以及低侵袭人乳腺癌细胞株中的表达 MDA-MB-435s以及MCF-7细胞株接种于培养基上进行细胞培养，取对数生长期细胞进行实验。采用RT-PCR方法测定AnnexinⅡ mRNA的表达情况。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。提取乳腺癌细胞的总RNA，所得RNA行逆转录合成cDNA。PCR反应，50 μL体系，预变性94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 35 s，延伸72℃ 5 min。其中变性-退火-延伸循环28次。凝胶电泳成像，分析灰度值。采用Western blot测定人乳腺癌细胞中AnnexinⅡ蛋白的表达。提取总蛋白，测定蛋白含量，SDS-PAGE电泳，转膜，分别加一抗、二抗进行免疫反应，显色，采用Quantity One凝胶图像处理系统分析条带的光密度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AnnexinⅡ在正常乳腺组织、导管原位癌、侵袭性导管癌组织中的表达

AnnexinⅡ在正常乳腺组织中主要表达在间质内，在乳腺导管上不表达，在导管原位癌以及侵袭性导管癌组织中在间质、血管、肿瘤组织上均有表达。AnnexinⅡ在正常乳腺组织表达的IOD值为（6.5±1.0）×106，在导管原位癌中表达的IOD值为（27.5±3.0）×106，在侵袭性导管癌组织中表达的IOD值为（40.0±11.0）×106。三组间比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），导管原位癌、侵袭性导管癌组织中的表达量显著高于正常乳腺组织，而侵袭性导管癌中的表达量显著高于导管原位癌（均P < 0.01）。见图1～4。

2.2 AnnexinⅡ mRNA及蛋白在不同人乳腺癌细胞株中的表达

AnnexinⅡ mRNA在高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s中的表达显著高于MCF-7株中的表达，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；AnnexinⅡ 蛋白在高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s中的表达显著高于MCF-7株中的表达，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

3 讨论

Annexin Ⅱ是一种依赖钙离子的磷脂结合蛋白，又名P36、ANX2、LIP2、LPC2、CAL1H、LPC2D、ANX2L4、PAP-IV。其基因位于15q21-q22，蛋白分子量为36 kD，在人体内皮细胞、单核/巨噬细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中表达丰富。以单体、二聚体以及四聚体方式存在，不同的形式生物学功能不同。人AnnexinⅡ的结构基因位于15q21-q22，含1.4 kb编码基因，并有3个假基因分别位于4号、9号、10号染色体上。人AnnexinⅡ结构基因含13个外显子和12个内含子。AnnexinⅡ由339个氨基酸残基组成，是Annexins家族A亚家族成员。与该家族其他成员一样，它在结构上都具有一个保守的羧基末端和一个可变的氨基末端。保守的羧基末端一般具有4个Annexin重复子，每一个重复子由大约70个高度保守氨基酸残基构成。每一个重复子有5个α螺旋结构，它们堆叠成致密的圆盘状。该结构域具有结合钙离子的能力，从而调节Annexin分子与磷脂分子的结合，故被称为所有Annexins家族成员的核心区域，被钙离子活化后可与膜磷脂结合的蛋白，参与膜转运及膜表面其他一系列依赖于钙调蛋白的活动。

AnnexinⅡ除了在细胞分泌、增殖、细胞骨架连接、纤溶等方面发挥重要的作用外，其还具有结合RNA的作用，结合到c-mycmRNA上，可上调c-Myc蛋白。越来越多的研究显示，AnnexinⅡ在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的作用。孟鑫等[9]研究显示AnnexinⅡ在胃癌中高表达。陈辉等[10]研究显示AnnexinⅡ可能参与了甲状腺乳头状癌的发生和发展。AnnexinⅡ四聚体在肿瘤的迁移过程中充当了组织型纤溶酶原活化剂、纤溶酶原的受体，产生活化的纤溶酶，活化基质金属蛋白酶，从而参与肿瘤的侵袭及转移过程[11-13]。

本研究对正常乳腺组织、乳腺癌组织中AnnexinⅡ的表达情况进行了分析，结果显示AnnexinⅡ在正常乳腺组织内仅仅表达在组织间质，在乳腺导管上皮细胞内部表达，但是在乳腺癌的上皮细胞胞质以及胞膜内均呈现高表达，并且在乳腺癌组织中的血管内皮细胞上也出现高表达。通过IOD进行定量分析，结果显示，AnnexinⅡ在侵袭性导管癌组织中的表达最高，在导管原位癌组织中的表达其次，在正常乳腺组织中的表达最低。提示AnnexinⅡ可能与乳腺癌的侵袭有关。为了进一步进行验证，分别选择了高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s以及低侵袭性人乳腺癌细胞株MCF-7进行研究，分析不同侵袭性人乳腺癌细胞株中AnnexinⅡ mRNA以及蛋白的表达情况。结果显示，在高侵袭性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s株中AnnexinⅡ mRNA以及蛋白的表达均显著高于低侵袭性人乳腺癌细胞MCF-7株。这进一步证实AnnexinⅡ可能与乳腺癌肿瘤细胞的侵袭性相关。

既往的定位研究显示，AnnexinⅡ在细胞内的分布广泛，不仅存在于细胞浆内，还存在于细胞核[14-15]。细胞浆内的两个AnnexinⅡ与2个s100A10形成四聚体，借助AnnexinⅡ的亲钙特性以及磷脂性转移到细胞膜，从而发挥一定的生物学功能。AnnexinⅡ可调节s100A10水平，并且能够屏蔽细胞内s100A10的泛素化信号，从而稳定细胞内s100A10蛋白水平。另外单体或者四聚体的AnnexinⅡ均能够结合F-肌动蛋白，发挥稳定细胞骨架的作用[16-17]。AnnexinⅡ还是一种生长调节基因，AnnexinⅡ单体可作为蛋白复合物的一部分，发挥增强DNA聚合酶α活性的作用，促进合成DNA[15]。AnnexinⅡ蛋白还可作为RNA结合蛋白，结合PolyG以及c-myc基因的mRNA上，形成mRNP，发挥调节c-myc基因mRNA翻译的作用，而c-Myc蛋白参与了细胞的增殖、代谢、更新、分化、凋亡[18]。丁滔等[19]研究显示，AnnexinⅡ在不同Gleason评分、前列腺特异性抗原水平、临床分期、不同危险度中的表达存在显著差异，认为AnnexinⅡ表达与前列腺癌的发生、进展及预后有关。

综上所述，AnnexinⅡ在乳腺癌中呈现高表达，并且随着肿瘤细胞侵袭性的增强，其表达水平也显著升高。提示其在肿瘤的发生、发展、侵袭转移过程中可能发挥了重要的作用。本次研究并没研究AnnexinⅡ在乳腺癌发生、发展、侵袭过程中发挥作用的具体机制，期望在今后的工作中能够进一步进行相关研究。

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（收稿日期：2014-10-10 本文编辑：张瑜杰）