灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒的制备及质量评价

祖洪碧，李小华（重庆市长寿区人民医院药学部，重庆 401220）

灯盏乙素（Scutellarin）即5，6，4′-三羟基黄酮-7-葡萄糖醛酸苷，是灯盏花素（Breviscapus）的主要有效成分，为菊科植物灯盏细辛（Erigeron breviscapus）的提取物。研究显示，灯盏乙素在降低血液黏度、降低外周阻力、扩张血管、增加动脉流量、减少血小板计数和抑制血小板凝集等方面都有很好的临床疗效[1-2]。目前，临床上其主要用于治疗脑供血不足、脑出血所致后遗症、脑血栓、冠心病、心绞痛等疾病[3]。但是，由于灯盏乙素水溶性很低、口服生物利用度差、半衰期短[4]，使其临床使用受到了限制。聚乙二醇-聚乳酸/羟基乙酸共聚物（PEG-PLGA）为两亲性嵌段聚合物，具有较好的生物降解特征和生物相容性，几乎无细胞毒性，有利于提高药物的稳定性和透膜能力，达到缓释和长效的结果。基于此，本研究制备了灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒，以期改善灯盏乙素的体内特征，增加其药效。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Tecnai G2型透射电子显微镜（厦门亿辰科技有限公司）；Zetasizer Nano ZS型纳米粒度及Zeta电位分析仪（英国Malvern仪器公司）；RE-5250型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；GL-21M型高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；MS300型恒温磁力搅拌器（上海般特仪器有限公司）；BS 210s型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药品与试剂

灯盏乙素对照品（批号：120914，纯度：99.58%）、灯盏乙素原料药（批号：120915，纯度：99.20%）均购自昆明龙津药业有限公司；PEG-PLGA（上海丽昂化学有限公司）；泊洛沙姆188（P188，湖北武汉健源化工有限公司）；聚山梨酯80和聚山梨酯20（天津市博迪化工有限公司）；丙酮（东莞市乔科化学有限公司）；乙酸乙酯、二氯甲烷购自深圳市科天化玻仪器有限公司，甲醇、乙腈为色谱纯，水为室验室自制的超纯水。

2 方法与结果

2.1 灯盏乙素的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：WelchromTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V），流速：1 ml/min；检测波长：335 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。该色谱条件下，灯盏乙素的出峰时间为9.7 min，其他辅料不干扰灯盏乙素的测定。

2.1.2 标准曲线制备 精密称取灯盏乙素对照品15.06 mg，用甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为7.53、15.06、30.12、60.24、90.36、120.48 μg/ml的系列对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（c）为横坐标，进行回归分析，得回归方程为y＝19 764.52c+583.74（r＝0.999 7）。结果表明，灯盏乙素检测质量浓度的线性范围为7.53～120.48 μg/ml。

2.1.3 回收率试验 取质量浓度为15.06、30.12、90.36 μg/ml的灯盏乙素对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，代入回归方程计算质量浓度，以实测值与真实值之比计算回收率。结果，低、中、高质量浓度灯盏乙素对照品溶液的回收率分别为（99.05±4.84）%、（99.58±3.70）%、（100.31±2.27）%，RSD均小于12%（n＝5）。

2.1.4 稳定性试验 取质量浓度为15.06、30.12、90.36 μg/ml的灯盏乙素对照品溶液，于室温放置4 h后，进样测定。结果测定值与0 h的偏差分别为1.79%、1.27%、1.08%（n＝5），表明该对照品溶液在室温条件下放置4 h稳定。

2.2 灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒的制备

采用复乳-溶剂蒸发法制备灯盏乙素-PEG-PLGA。首先将适量的灯盏乙素溶于水中，取适量体积的灯盏乙素水溶液加入一定体积的有机相中，水浴超声制得初乳，然后将初乳注入到一定体积的乳化剂水溶液中，超声20 min得到复乳。将复乳旋转蒸发，除去全部的有机溶剂，于4 ℃、离心半径10 cm、16 000 r/min低温高速离心40 min后，除去上清液，得到灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒。

2.3 指标检测

采用Zetasizer Nano ZS型纳米粒度及Zeta电位分析仪测定所制灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒的粒径和粒径分布指数（PDI）。采用高速离心法分离灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒，以甲醇破乳，以纳米粒的质量与游离药物质量进行包封率（ER）的考察[5]，包封率计算公式为ER＝（1－m游/m总）×100%。

2.4 单因素试验筛选处方

2.4.1 不同有机相对纳米粒的影响 以粒径、PDI、包封率为指标，分别以丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷为有机相，按“2.2”项下方法制备纳米粒，考察不同有机相对纳米粒的影响。结果显示，3种有机相所制纳米粒的粒径依次为（73.4±1.2）、（79.6±1.7）、（85.3±3.1）nm，PDI依次为0.102、0.137、0.294，包封率依次为（33.68±1.11）%、（29.12±1.36）%、（21.44±1.75）%，n＝3。这表明采用丙酮制得的纳米粒具有较小的粒径和PDI值，且包封率较高，因此选择丙酮作为有机相。

2.4.2 内水相与有机相不同比例对纳米粒的影响 以粒径、PDI、包封率为指标，以内水相与有机相比例分别为1∶5、1∶10、1∶15，按“2.2”项下方法制备纳米粒，考察不同内水相与有机相比例对纳米粒的影响。结果显示，内水相与有机相3种比例所制纳米粒的粒径依次为（71.1±1.3）、（73.5±1.6）、（75.2±1.9）nm，PDI依次为0.104、0.102、0.199，包封率依次为（33.59±1.21）%、（30.22±1.19）%、（25.36±1.69）%，n＝3。这表明内水相和有机相的比例为1∶5时所制纳米粒粒径较小，包封率较高。虽然比例为1∶10时所制纳米粒PDI略低于比例为1∶5时，但综合考虑，选择内水相和有机相的比例为1∶5。

2.4.3 不同乳化剂对纳米粒的影响 以粒径、PDI、包封率为指标，以泊洛沙姆、聚山梨酯80和聚山梨酯20为乳化剂，按“2.2”项下方法制备纳米粒，考察不同乳化剂对纳米粒的影响。结果显示，3种乳化剂所制纳米粒的粒径依次为（76.4±1.6）、（72.6±1.5）、（78.9±1.8）nm，PDI依次为0.103、0.105、0.176，包封率依次为（34.63±1.25）%、（35.82±1.33）%、（27.25±1.57）%，n＝3。这表明采用聚山梨酯80为乳化剂时所制纳米粒具有较小的粒径和较高的包封率，综合考虑，选择聚山梨酯80为乳化剂。

2.4.4 聚山梨酯80不同体积分数对纳米粒的影响 以粒径、PDI、包封率为指标，以聚山梨酯80体积分数分别为0.2%、0.5%、1%，按“2.2”项下方法制备纳米粒，考察聚山梨酯80不同体积分数对纳米粒的影响。结果显示，3种体积分数的聚山梨酯80所制纳米粒的粒径依次为（74.5±1.6）、（73.8±1.5）、（75.3±1.9）nm，PDI依次为0.107、0.105、0.110，包封率依次为（32.35±1.28）%、（36.27±1.25）%、（35.96±1.38）%，n＝3。这表明聚山梨酯80体积分数为0.5%时所制纳米粒包封率较高，且3种体积分数的聚山梨酯80对纳米粒的粒径和PDI值影响不大，因此聚山梨酯80的体积分数确定为0.5%。

2.4.5 初乳与外水相不同比例对纳米粒的影响 以粒径、PDI、包封率为指标，以初乳与外水相比例分别为1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15，按“2.2”项下方法制备纳米粒，考察初乳与外水相不同比例对纳米粒的影响。结果显示，初乳与外水相3种比例所制纳米粒的粒径依次为（76.3±2.1）、（79.4±2.5）、（69.5±2.2）nm，PDI依 次 为0.101、0.126、0.103，包封率依次为（21.36±2.25）%、（33.57±2.67）%、（49.33±2.31）%，n＝3。这表明初乳与外水相的比例为1 ∶15时所制纳米粒包封率较高、粒径较小，因此选择初乳与外水相的比例为1∶15。

2.4.6 不同质量浓度灯盏乙素对纳米粒的影响 以粒径、PDI、包封率为指标，以灯盏乙素质量浓度分别为5、10、20 mg/ml，按“2.2”项下方法制备纳米粒，考察不同质量浓度灯盏乙素对纳米粒的影响。结果显示，3种质量浓度灯盏乙素所制纳米粒的粒径依次为（81.2±2.3）、（76.6±1.8）、（79.2±2.1）nm，PDI依次为0.093、0.095、0.120，包封率依次为（31.59±1.05）%、（47.33±1.17）%、（34.86±2.01）%，n＝3。这表明灯盏乙素质量浓度为10 mg/ml时所制纳米粒具有较高的包封率、较小的粒径。

2.4.7 不同质量浓度PEG-PLGA对纳米粒的影响 以粒径、PDI、包封率为指标，以PEG-PLGA质量浓度分别为5、15、25 mg/ml，按“2.2”项下方法制备纳米粒，考察不同质量浓度PEG-PLGA对纳米粒的影响。结果显示，3种质量浓度PEGPLGA所制纳米粒的粒径依次为（81.7±2.9）、（77.5±2.2）、（79.4±2.7）nm，PDI依次为0.131、0.117、0.119，包封率依次为（40.22±1.37）%、（45.76±1.25）%、（42.33±1.28）%，n＝3。这表明PEG-PLGA质量浓度为15 mg/ml时所制纳米粒粒径较小、包封率较高，因此选择PEG-PLGA质量浓度为15 mg/ml。

2.5 正交试验优选处方

选取对包封率影响较大的初乳与外水相的比例（A）、灯盏乙素质量浓度（B）、PEG-PLGA质量浓度（C）为因素，以包封率为指标，进行正交试验优化处方。因素与水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验结果Tab 2 Result of orthogonal test results and range

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

由表2和表3结果可知，影响包封率的因素依次为A＞B＞C，但相关因素对微乳的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。根据试验结果，选择最优处方为A2B2C2，即初乳与外水相的比例为1 ∶15，灯盏乙素质量浓度为10 mg/ml，PEG-PLGA质量浓度为15 mg/ml。

2.6 灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒的质量评价

2.6.1 表观形态 采用透射电镜观察纳米粒的形貌，结果显示，灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒为圆形或者椭圆形，粒径为70～80 nm。灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒的透射电镜图见图1。

2.6.2 粒径与Zeta电位 试验结果显示，灯盏乙素-PEGPLGA载药纳米粒的平均粒径为（78.54±2.21）nm，Zeta电位为（－23.07±1.39）mV。灯盏乙素-PEG-PLGA纳米粒的粒径分布图见图2。

2.6.3 包封率和载药量测定 试验结果显示，灯盏乙素-PEGPLGA载药纳米粒的载药量为（1.67±0.12）%，包封率为（45.32±1.29）%。

图1 灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒的透射电镜图Fig 1 Transmission electron microscopy figure of scutellarin-PEG-PLGA nanoparticles

图2 灯盏乙素-PEG-PLGA纳米粒的粒径分布图Fig 2 Particle size distributions of scutellarin-PEG-PLGA nanoparticles

2.6.4 稳定性考察 将灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒分装于安瓿瓶中，于4 ℃条件下保存。分别在保存1、2、3个月时取出样品测定其粒径和包封率，评价其4 ℃条件下保存的稳定性。结果显示，在不同时间测定样品，其粒径和包封率都无明显变化，表明灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒在4 ℃条件下，3个月内能保持稳定。

3 讨论

目前，临床上用到的灯盏花素剂型主要为片剂、颗粒剂、注射剂、注射用无菌粉末等[6-7]，此外，也有多种速释制剂以及缓控释制剂处于研发阶段。由于其理化性质制约着其疗效的发挥，各种新型制剂的研发、改善其体内过程以增加其疗效，成为灯盏花素药物研究当中的一个趋势[8-9]。

PEG-PLGA是以聚乙醇酸和聚乳酸聚合而成，其核心成分为PLGA，聚乳酸亲水性较差、降解较慢，而聚乙醇酸则亲水性较好、降解较快，两者结合在一起有利于完善其化学性质，可对药物产生较强的保护作用，且具有较强的靶向性[10-11]。将灯盏乙素制备成灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒有利于其被巨噬细胞吞噬到达网状内皮系统，延缓药物的释放，且可以使药物在肠道停留时间延长，增加其吸收；此外，有利于保护药物，减少胃酸对其破坏，提高药物的体内稳定性，有利于提高药物的透膜能力。目前，PEG-PLGA被公认为一种良好的生物可降解材料，广泛应用于药物新剂型的设计。

本试验制备灯盏乙素-PEG-PLGA载药纳米粒的工艺简单、制剂稳定性好，有利于实现灯盏乙素体内的长效循环以及增加其透过血脑屏障的量。后续将进一步对其体内外特征进行研究，为灯盏乙素新剂型的开发和临床使用提供参考。

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