肿瘤坏死因子-α预处理与缺血预处理在减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用

郭怀斌，赵　炎，刘　峰，岳立辉，张万星　(.河北省人民医院普外三科，河北 石家庄 05005；.河北省人民医院基建处，河北 石家庄 05005；.河北省人民医院麻醉科，河北 石家庄 05005)



肿瘤坏死因子-α预处理与缺血预处理在减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用

郭怀斌1，赵炎2，刘峰1，岳立辉3，张万星1(1.河北省人民医院普外三科，河北 石家庄 050051；2.河北省人民医院基建处，河北 石家庄 050051；3.河北省人民医院麻醉科，河北 石家庄 050051)

[摘要]目的研究采用肿效瘤坏死因子-α(TNF-α)预处理与采用缺血预处理两种方法对减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤(IRI)的作用效果，并探讨采用TNF-α预处理减轻大鼠肝脏IRI的机制。方法将40只Wistar大鼠随机分为4组：假手术组(SO组)仅行开腹及游离肝十二指肠韧带；缺血再灌注组(IR组)采用Pringle’s法阻断肝门30 min，再灌注6 h；缺血预处理组(IPC组)采用Pringle’s法阻断肝门10 min，开放血流10 min，此后操作同IR组；TNF-α预处理组(TPC组)，术前30 min给予TNF-α 1μg/kg腹腔注射，此后操作同IR组。检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，采用免疫组织化学检测Bcl-2蛋白和NF-κB p65蛋白表达情况，以及肝细胞凋亡指数(AI)。 结果IPC组血清ALT、AST水平为(316.4±90.6)U/L、(316.4±90.6)U/L，TPC组为(336.8±79.4)U/L、(392.7±109.3)U/L，与IR组(642.8±149.3)U/L、(730.6±103.0)U/L比较明显降低，P<0.05差异有统计学意义；肝细胞凋亡评分AI在IPC组(4.36+0.88)和TPC组(4.94+2.04)明显降低，与IR组(9.48+2.42)比较，P<0.05差异有统计学意义；肝组织内Bcl-2蛋白阳性表达在IPC组(62.30+9.20)和TPC组(60.99+6.30)升高，与IR组(11.45+11.97)比较，有显著性差异(P<0.05)；NF-κB p65阳性表达在IPC组(31.56+4.85)和TPC组(32.80+5.30)明显降低，与IR组(68.33+6.07)比较，有显著性差异(P<0.05)。上述各项指标在IPC组与TPC组间，差异无统计学意义(P>0.05)。 结论采用TNF-α预处理与缺血预处理对减轻大鼠肝脏IRI的效果一致，TNF-α预处理通过抑制NF-κB p65蛋白表达、激活凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达，减轻了大鼠肝脏IRI。

[关键词]肝脏；缺血再灌注损伤；肿瘤坏死因子-α；缺血预处理

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α )作为一个重要的细胞因子，在肝脏热缺血再灌注损伤过程发挥着重要作用[2-6]。在大鼠肝脏IRI过程中，采用TNF-α预处理的方法能明显减轻大鼠肝脏IRI程度[7]。我们研究采用TNF-α预处理能否对肝脏IRI产生保护作用，以及与IPC的保护效果作比较，为临床上减轻肝脏IRI探索一条新的途径，并通过观察凋亡抑制基因Bcl-2及核因子NF-κB在肝组织中的表达情况，初步探讨采用TNF-α预处理对减轻肝脏IRI的机制。

1材料与方法

1.1材料

健康清洁级Wistar大鼠40只(河北医科大学动物中心提供)，体质量250～300 g，TNF-α(美国Santa Cruz公司)；Bcl-2免疫组化试剂盒(美国Santa Cruz公司)；NF-κB p65免疫组化试剂盒(美国Santa Cruz公司)；DAB显色试剂盒(美国Zymed公司)；原位细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)；蛋白酶K(美国Amresco公司)。

1.2动物分组与模型制备

随机分为假手术对照组(SO组，n=10)；缺血再灌注组(IR组，n=10)；缺血预处理组(IPC组，n=10)； TNF-α预处理组(HTPC组，n=10)。实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。腹腔注射氯胺酮麻醉，取上腹正中切口，向上牵开肝脏，显露并游离肝十二指肠韧带。IR组，小号无损伤血管夹夹闭肝十二指肠韧带致肝缺血30 min，然后松开血管夹恢复灌注，检查确切开放血流后关闭腹腔。腹腔内给予庆大霉素0.3 g，并向腹腔内注射2 mL生理盐水补液。单独笼养，禁食、禁水。IPC组，小号无损伤血管夹夹闭肝十二指肠韧带致肝缺血10 min，然后松开血管夹恢复灌注10 min，随后操作同IR组。TPC组，术前30 min给予TNF-α腹腔注射预处理，剂量1 μg/kg，其余操作同IR组。SO组，仅游离肝十二指肠韧带，不再做任何处理，然后关闭腹腔。各组大鼠于再灌注6 h后再次麻醉，经心脏采血5 mL，不加抗凝剂，静置10 min，离心后取上层血清用于检测肝功变化。取肝右叶肝组织迅速切成0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小的组织块置于4%中性多聚甲醛溶液中及时固定，做石蜡切片后行HE染色及免疫组织化学检测。

1.3血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶的测定

利用日立全自动生化分析仪,按说明书测定血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶。

1.4Bcl-2蛋白和NF-κB p65蛋白表达的检测

也许这一事件最后不过是为孟山都、为农药的是是非非之争又增添了一个案例。但透过这些是是非非，我们还是看到了很多值得思考的问题。

采用免疫组织化学检测各组Bcl-2蛋白和NF-κB p65蛋白的表达。Bcl-2蛋白表达以细胞浆内呈棕黄色或黄色的颗粒或团块为阳性细胞。NF-κB p65蛋白表达以细胞浆呈棕黄色着染为阳性细胞。每组内每张切片随机挑选10个200倍视野进行拍照，对每张照片计算阳性指数(PI)。PI= (N1+N2+…+ Nn)/n(n=10)。

1.5细胞凋亡检测

采用原位细胞凋亡检测，阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色着染。方法同上，计算凋亡指数(AI)。AI= (A1+A2+…+An)/n(n=10)。

1.6统计学处理

2结果

2.1血清ALT、AST水平

IR组、IPC组和TPC组血清ALT、AST水平明显升高，与SO组比较，P<0.05差异有统计学意义。其中IR组升高最明显，与IPC组、TPC组比较，P<0.05差异有统计学意义。IPC组与TPC组比较，P>0.05差异无统计学意义(表1)。

2.2Bcl-2蛋白的表达

Bcl-2蛋白阳性表达在IPC组和TPC组表达明显，而在SO组、IR组较少，差异有统计学意义(P<0.05)。SO组与IR组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。IPC组与TPC组比较，P>0.05差异无统计学意义(表2)。

2.3NF-κB p65蛋白的表达

NF-κB p65蛋白阳性表达在IR组、IPC组和TPC组表达明显，在SO组较少，P<0.05差异均有统计学意义，其中IPC组、TPC组NF-κB p65阳性表达较IR组减低，P<0.05差异有统计学意义。IPC组与TPC组比较，P>0.05差异无统计学意义(表2)。

组别ALTASTSO61.6±11.375.8±46.6IR642.8±149.3*730.6±103.0*TPC336.8±79.4*#392.7±109.3*#IPC316.4±90.6*#△376.4±127.0*#△

*:与SO组比较，P<0.05；#:与IR组比较，P<0.05；△:与TPC组比较，P>0.05

组别Bcl-2PI(%)NF-κBPI(%)SO12.99±3.2110.15±4.42IR11.45±11.9768.33±6.07*TPC60.99±6.30*#32.80±5.30*#IPC62.30±9.20*#△31.56±4.85*#△

*:与SO组比较，P<0.05；#:与IR组比较，P<0.05；△:与TPC组比较，P>0.05

2.4细胞凋亡检测

凋亡细胞在SO组罕见，IR组、IPC组和TPC组都有明显增加。凋亡指数(AI)在IR组(9.48±2.42)、IPC组(4.36±0.88)和TPC组(4.94±2.04)，与SO组(1.29±2.67)比较，P<0.05差异均有统计学意义，其中IR组AI增加最明显，与IPC组、TPC组比较，P<0.05差异有统计学意义。IPC组与TPC组比较，P>0.05差异无统计学意义。

3讨论

肝脏IRI是多种因素以时间为顺序先后作用的结果，细胞因子在肝脏IRI中有重要作用，其中TNF-α的作用，尤为重要[2-6]。TNF-α在肝脏IR过程中介导了导致肝细胞损伤的多形核粒细胞浸润、释放ROS、TNF-α和多种蛋白酶,以及激活枯否细胞，并诱导枯否细胞释放ROS和 TNF-α，导致更多多形核粒细胞浸润，加重肝细胞损伤[2]。核因子kappa-B(NF-κB)是一个多种基因的快速反应转录因子,在肝脏IRI发挥调解中心的作用[2]。IPC能减轻大鼠肝脏IRI，与抑制核因子NF-κB在肝组织中的表达，减少细胞因子、活性氧和氮化物、钙、补体等的表达有关[1]。

本实验结果显示，肝脏在遭受缺血30 min，再灌注后发生了明确的再灌注损伤，采用TNF-α预处理后，明显的减轻了肝脏IRI。TNF-α预处理后，抑制了NF-κB p65蛋白表达。NF-κB p65蛋白高表达与肝脏IRI严重程度密切相关，NF-κB p65蛋白表达被抑制，则肝脏IRI减轻[1，6-7]。本实验结果显示TNF-α预处理抑制了NF-κB p65蛋白表达，减轻了肝脏IRI。

在肝脏IRI中，肝脏细胞大量死亡和凋亡，凋亡和死亡的比例，与肝脏IRI严重程度并不成比例关系，而与肝脏细胞脂肪含量有关[2]。在肝脏IR过程中，TNF-α可激活凋亡相关蛋白的表达，诱导肝脏细胞凋亡，加重肝脏IRI[2]。但TNF-α预处理可以减少肝脏细胞凋亡[8]。减少肝脏细胞凋亡可以减轻肝脏IRI，IPC能减少肝脏IRI过程中肝脏细胞凋亡，从而减轻大鼠肝脏IRI[1，9]。本实验结果显示，TNF-α预处理后，在随后的IR阶段，大鼠肝脏细胞AI明显低于IR组，而Bcl-2蛋白表达明显增高，显著高于IR组。本实验结果提示，TNF-α不但激活了凋亡诱导基因的表达，也激活了凋亡抑制基因Bcl-2的表达，TNF-α预处理后，在随后的IR过程中，Bcl-2高表达，抑制了IR后大鼠肝脏细胞凋亡。以及激活凋亡抑制基因Bcl-2，减少肝脏RI导致的肝细胞凋亡。

两种方法的预处理(TNF-α预处理和IPC)，无论血清酶学检查，还是肝细胞坏死、凋亡检查角度上分析，对减轻肝脏IRI的程度上没有显著差别。两种方法的预处理抑制NF-κB p65蛋白表达程度相似，在激活凋亡抑制基因Bcl-2表达程度上亦相似。

综上所述，TNF-α预处理对大鼠肝脏RI造成的肝损伤有保护作用[8]，与IPC效果相似。TNF-α预处理通过抑制NF-κB p65蛋白表达、激活凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达，减轻了IR后大鼠肝脏IRI。

[参考文献]

[1] Zhang WX,Yin W,Zhang L,et al.Precondioning and postconditioning reduce hepatic ischemia-reperfusion injury in rats[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2009,8(6):586-590.

[2] Montalvo-Jave EE,Escalante-Tattersfield T,Ortega-Salgado JA,et al.Factors in the pathophysiology of the liver ischemia-reperfusion injury[J].Surg Res,2008，147(1):153-159.

[3] 白丽,任锋,郑素军,等.抑制PTEN对小鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及其机制[J].中华肝脏病杂志,2014,22(6):451-455.

[4] 任锋,张海燕,朴正福,等.抑制糖原合成酶激酶3活性对Toll样受体4介导肝脏炎症反应的调节作用[J].中华肝脏病杂志,2012,20(9):693-697.

[5] Gao Z,Li YH.Antioxidant Stress and Anti-Inflammation of PPARα on Warm Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury[J].PPAR Res,2012,12:738-785.

[6] Jaeschke H,Woolbright BL.Role of heme oxygenase 1 in TNF/TNF receptor-mediated apoptosis after hepaticischemia/reperfusion in rats[J].Shock,2013,40(1):75-6.

[7] Arii S,Monden K,Adachi Y,et al.Pathogenic role of Kupffer cell activation in the reperfusion injury of cold-preserved liver[J].Transplantation,1994,58(10):1072-1077.

[8] Feng M,Wang Q,Wang H,et al.Tumor necrosis factor-alpha preconditioning attenuates liver ischemia/reperfusion injury through preserving sarco/endoplasmic reticulum calcium-ATPase function[J].J Surg Res,2013,184(2):1109-1113.

[9] 张智勇,卢绮萍,陈孝平.丹参预处理对肝脏缺血再灌注后胃肠激素的影响[J].中华消化外科杂志,2014,13(3):213-217.

(编辑：左艳芳)

Effect of tumor necrosis factor-alpha preconditioning and ischemic preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats

GUO Huai-bin1，ZHAO Yan2，LIU Feng1，YUE Li-hui3,ZHANG Wan-xing1(1.Department of General Surgery,Hebei Provincial General Hospital，Shijiazhuang Hebei 050051，China;2.Infrastructure Department,Hebei Provincial General Hospital，Shijiazhuang Hebei 050051，China;3.Department of Anesthesiology,Hebei Provincial General Hospital，Shijiazhuang Hebei 050051，China)

Abstract:ObjectiveTo compare the effect of TNF-α preconditioning and ischemic preconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury (IRI) and investigate the underlying mechanisms of TNF-α preconditioning. MethodsFourty healthy male Wistar rats were randomly divided into four groups which were Sham-operated group (SO),ischemia-reperfusion group (IR group:produced by total inflow occlusion for 30 min),ischemic preconditioning group (IPC group:induce with 10 min hepatic ischemic and open 10 min before IR) and TNF-α preconditioning group (TPC group:intraperitoneal injection with 1 μg/kg TNF-a 30 min prior to IR).The sample of blood and hepatic tissue of all groups were taken after experiment.The protein levels of NF-κBp65 and Bcl-2 in the hepatic tissue were detected by immunohistochemistry. ResultsThere was significant difference (P<0.05) between IR group and IPC group,TPC group on the level of ALT,AST and the xpression of NF-κBp65 and Bcl-2,apoptosis index in hepatic tissue.There was no significance difference (P>0.05) between IPC group and TPC group. ConclusionTNF-α preconditioning decreased the intensity of hepatic IRI,just as ischemic preconditioning,by induces an decrease in the NF-κBp65 expression and an increase in the Bcl-2 expression.

Keywords:liver;ischemia-reperfusion injury;TNF-α;ischemic preconditioning

[收稿日期]2014-09-29[修回日期] 2014-10-24

doi:10.11659/jjssx.09E014026

[中图分类号]R36；R657.3

[文献标识码]A

[文章编号]1672-5042(2015)01-0070-03