Tween遮蔽RBC表面抗原制备通用血型的初步研究

陈洪宇，韩　威，姜　恒，尹晓琳，李　辉，李玉麒，伍成淑　(.成都医学院检验医学院医学检验输血方向本科班，四川 成都 60500；.成都医学院检验医学院临床输血教研室，四川 成都 60500)



Tween遮蔽RBC表面抗原制备通用血型的初步研究

陈洪宇1，韩威2，姜恒2，尹晓琳1，李辉1，李玉麒1，伍成淑1(1.成都医学院检验医学院医学检验输血方向本科班，四川 成都 610500；2.成都医学院检验医学院临床输血教研室，四川 成都 610500)

[摘要]目的探讨Tween对红细胞表面抗原(主要是ABO和D抗原)的遮蔽效果以及红细胞的稳定性。方法采用不同浓度的Tween孵育不同血型红细胞，并对其孵育前后抗原效价进行比较，以及采用形态观察，渗透脆性、自身溶血率、氧饱和度(SO2)、RBC平均指数检测和上清液游离血红蛋白测定判断孵育后红细胞的基本功能变化，以证实其稳定情况。结果Tween-20对D抗原的孵育效果较好且稳定，减弱程度保持在“+”以上，B抗原遮蔽略差且并不稳定，A抗原的遮蔽效果较弱，优势浓度在0.004%附近。Tween-80对D、B遮蔽效果差异并不明显，在0.74%、0.80%附近遮蔽效果较好，保持在“+”以上。结论Tween-20，Tween-80可以遮蔽RBC表面抗原，并使其减弱程度保持在“+”以上，RBC形态及功能没有发生变化。

[关键词]红细胞表面抗原；Tween-20;Tween-80；化学修饰；通用血型

输血治疗的原则是供受者血型相同或相容。在当今社会，器官移植已逐渐成为一种常见的治疗方式，而输注红细胞是其中最常见也是耐受性最好的一种移植手段。血型系统尤其是ABO和Rh血型系统在输血中具有重要的作用，ABO血型不合引起输血反应的概率是100%，而RhD不合也有50%的可能。一般情况下，要求输入相同型血，但在紧急情况下，例如稀有血型、重大自然灾害、战争等，由于不能保证同型血的及时供应，一般要求以交叉配血相容为前提的异型输血，一般以O型血作为供血者。对此，希望能通过生物技术将A、B和AB型红细胞转化成通用的O型红细胞，使用大分子化学材料对细胞抗原进行遮蔽，避免机体免疫系统的攻击，使供体组织器官能更好地在受者体内生存是一种比较简单可行的方法。

美国研究员Scott利用化学材料：甲氧基聚乙二醇(methoxy polyethylene glycol，mPEG)修饰红细胞发现以共价键结合在RBC膜上的mPEG可以阻断抗-A、抗-B对A、B抗原的凝集反应。但是，后又有试验证明mPEG并不能完全遮蔽抗原，并不能达到临床输血前配血标准，并有考虑到PEG抗体存在的可能性[1-4]。本实验室期望能找到另一种化学材料能够起到更好的抗原遮蔽作用。聚山梨醇酯(Tween,Polysorbate，吐温)，与PEG有类似理化性质，是一种非离子型表面活性剂，为淡黄色至橙黄色的黏稠液体，其结构中既有亲水基团，又有亲油基团。现将A、B、O 3种红细胞采用Tween-20、Tween-80进行化学修饰，并观察其修饰红细胞A、B和D抗原的遮蔽效果，作出初步研究。

1材料与方法

1.1研究对象

收集合格的健康献血者A、B、O三种血型红细胞(枸橼酸盐抗凝)。

1.2主要试剂和仪器

Tween-20(购自美国Sigma公司，批号P1379，规格25 mL);Tween-80(购自美国Sigma公司，批号P1754，规格25 mL);抗-A、抗-B血型定型试剂(单克隆试剂；购自上海血液生物医药有限责任公司，批号20110820);RhD(IgM)血型定型试剂(单克隆抗体；购自上海生物医药有限责任公司，批号20110218);0.9%氯化钠注射液(购自四川科伦药业股份有限公司，生产批号M11072715);自配pH 7.0～7.5等渗磷酸盐缓冲液[4]。血型血清学专用离心机(KUBOTA HA-2200，日本);721分光光度计(T6新世纪，北京谱析仪器有限责任公司);电子天平(MP2002，上海舜宇横平科学仪器有限公司)；优普纯水机(购自成都超纯科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1Tween孵育红细胞用生理盐水洗涤红细胞3次(2 500 r/min，1 min离心，弃上清)。将制备好的新鲜红细胞压积加至自制PBS配制的孵育液，使终浓度为Tween-20:0.40‰,0.44‰,0.52‰;Tween-80:0.74‰,0.80‰,0.82‰。加入后轻轻混匀，A、B型置于4 ℃，O型室温孵育2 h,期间每0.5 h混匀1次，以加强反应。

1.3.2Tween孵育后红细胞表面抗原效价测定2 h后取出，弃上层清液，用生理盐水洗涤3次，方法同上。后配成2%～5%红细胞悬液，与相应抗血清1∶1反应，测定抗原效价。

1.3.3Tween孵育前后红细胞形态观察，渗透脆性、自身溶血率和氧饱和度(SO2)检测取被Tween孵育后和对照组RBC做推片，经瑞士染色，在光学显微镜下观察其细胞形态的变化；取Tween孵育后与对照组的RBC悬液(50%)10 μl加入1.25 mL按《全国临床检验操作规程》第2版配制的41.0 ～116.3 mmol/L的NaCl梯度溶液，判断RBC的渗透脆性变化；取Tween组与实验组的RBC置37 ℃ 48 h，离心3 min(1 000 r/min)取上层清液，以PBS等渗液为空白对照，检测上清液在540 nm处的光吸收值，计算RBC自身溶血率，以溶血者对照管测定值作为阳性对照(正常RBC)，以PBS等渗液测定值作为阴性对照；SO2用血气检测试剂(由德国罗氏诊断有限公司提供)测定。

1.3.4Tween孵育前后红细胞形态观察，渗透脆性、自身溶血率和氧饱和度(SO2)检测查看血细胞分析仪MCV、MCH、MCHC、RDW-SD、RDW-CV及Tween 孵育液是否是红细胞产生肉眼不可见溶血，使用邻家联苯胺法[5]测定上清中游离血红蛋白量。

2结果

2.1不同浓度遮蔽红细胞上A、B和D抗原的情况

通过试管法在抗血清1∶4～1∶32的浓度下分别进行凝集反应，发现Tween-20对D抗原的孵育效果较好且稳定，减弱程度保持在“+”以上，B抗原遮蔽略差且并不稳定，A抗原的遮蔽效果较弱，优势浓度在0.4‰附近。Tween-80对D、B遮蔽差异并不明显，在0.74%、0.80%附近遮蔽效果较好，保持“+”以上(表1)。

表1　不同浓度遮蔽红细胞上A、B和D抗原的情况

+～4+:凝集程度逐渐增强;w:表示偏弱红细胞功能改变情况

2.2红细胞功能改变情况

红细胞孵育前后形态涂片检查无异常，红细胞仍为正常大小的双凹圆盘状；渗透脆性较空白正常或略减弱，但都在P<0.05；自身溶血率较空白略高，P<0.05，其中Tween-800.74%、0.82%与空白相比，差异具有统计学意义，见表2；SO2都高于97%(参考值：95%～99%)。

2.3红细胞形态变化

HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW-SD、RDW-CV都处于正常范围内(表3)；孵育液(孵育后留取上清)血红蛋白量趋于0，见表2、表3。

3讨论

Tween-20及Tween-80分子中有较多的亲水性基团一聚氧乙烯基，故亲水性强，为一种非离子型去污剂，二者区别在于Tween的编号依聚合山梨醇所结合的脂肪酸种类不同而定，Tween系列产品常作为乳化剂广泛用在食品，化妆品和其他行业中。Tween-80已经在大量的经口途径或非消化道途径的药物制剂中应用，对其安全性进行了较为深入的研究。Tween-20、Tween-80对红细胞均有溶血作用，以Tween-80作用最弱。二者与PEG具有相似的理化性质，国内最近几年

表2　红细胞功能改变情况

*：与对照组比较，P<0.05

许多人士对PEG对红细胞表面抗原遮蔽效果进行研究，研究结果表明PEG对红细胞表面抗原有遮蔽的作用，为制备通用血型奠定了基础[5-11]。本实验证明了不同浓度Tween-20、Tween-80对红细胞的遮蔽效果有明显差异，Tween-20对D抗原的孵育效果较好且稳定，减弱程度保持在“+”以上，B抗原遮蔽略差且并不稳定，A抗原的遮蔽效果较弱，优势浓度在0.40‰附近。Tween-80对D、B遮蔽差异并不明显，在0.74%、0.80%附近遮蔽效果较好，保持“+”以上，说明Tween-20、Tween-80也具有和PEG类似的抗原屏蔽作用，但是目前的研究机制尚未清楚，有待进一步研究。尽管化学物质遮蔽红细胞的抗原的研究还存在一些问题，但它为制备通用型血的研究提供了很多线索，具有很大的研究价值和应用前景。未来，人们可望达到既完全遮蔽红细胞的血型抗原，又不影响其形态、结构、功能和寿命的目的，最终实现制备通用型血液的目标。

[参考文献]

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(编辑：杨颖)

Preliminary study on preparation of universal blood type through masking RBC’s surface antigen with Tween

CHEN Hong-yu1,HAN Wei2,JIANG Heng2,YIN Xiao-lin1,LI Hui1,LI Yu-qi1,WU Cheng-shu1(1.Undergraduate Classes of Medical Transfusion Direction,Chengdu Medical College,Chengdu Sichuan 610500,China；2.Teaching and Research Section of Blood Transfusion,Chengdu Medical College,Chengdu Sichuan 610500,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the shielding effect that Tween has made on the erythrocyte’s surface antigen(ABO and D antigen mainly) and the stability of the RBC. MethodsVarious types red blood cells’ surface antigens were incubated with different concentrations of Tween,then the titers of RBC’s surface antigen before and after incubation were compared. The erythrocyte’s function alterations and stability through the morphological obersavation,the osmotic fragility,RBC’s own hemolysis rate,oxygen saturation(SO2),routine test of blood as well as the supernatant of free hemoglobin determination were confirmed. ResultsThe masking effect of the Tween-20 on D antigen with the weaken titer keeping above “+” was better and more stable than that on A,B antigen.The impact on B antigen was a little worse,and A was the worst.The advantaged concentration is about 0.004%.Besides,the influence of Tween-80’s on B and D antigen was not apparent enough.Among all of the concentration,0.74% and 0.80% did a relatively better job,which also could keep the weaken titer above “+”. ConclulsionThe shielding effect that Tween has made on the erythrocyte’s surface antigen(ABO and D antigen mainly) is stable,which keeps above “+”.The morphology and function of the RBC does not change.

Keywords:surface antigens on red blood cells;Tween-20;Tween-80;chemical modification;universal blood type

[收稿日期]2014-08-29[修回日期] 2014-09-17

[基金项目]成都医学院大学生创新性实验项目(CX201112)

doi:10.11659/jjssx.06E014388

[中图分类号]R331.141;R457.1

[文献标识码]A

[文章编号]1672-5042(2015)01-0060-03