甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析筛查大肠癌的性能评价＊

肖著军，萧著玲，陈金敏，邓飞鸿，许岸高

（1.惠州市中山大学惠亚医院消化内科，广东惠州516081；2.湖南省永州市蓝山县中心医院消化科 425800；3.南方医科大学南方医院消化内科，广州510515；4.广东省惠州市医学研究所 516003）

目前，全球大肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和病死率居第3位，而且有逐年上升的趋势。在中国，随着经济社会的快速发展，人们饮食结构发生较大变化，CRC发病率也逐年升高[1]。有研究发现，诊断为CRC早期的患者中5年生存率可超过90%，而伴有淋巴结转移的，5年生存率大约只有60%，如果出现有远处转移则5年生存率不到10%[2]。因此，CRC早期筛查是影响其预后的关键因素。而CRC筛查常用的粪便潜血（faecal occult blood testing，FOBT）、结肠镜和CT结肠成像术等方法都难以完全达到安全简便、接受性好和成本效益好等大规模筛查的要求，寻求更理想的筛查方法是当务之急。粪便DNA检测作为一种非侵袭性、简便并具有很高敏感性和特异性的方法深受人们的欢迎[3]。但是，目前粪便DNA检测费用较高，还不能用于CRC的筛查[3-5]。自从2001年Worm等[6]首次运用高分辨率熔解曲线分析（high-resolution melting，HRM）检测CpG岛甲基化以来，先后有人用此技术检测大肠肿瘤患者血液和组织中基因甲基化，其检出率分别为48.0%[7]和33.3%～63.0%[8]，都取得了理想的结果。大量研究证实甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（methylation-sensitive high-resolution melting，MS-HRM）作为一种PCR后闭管操作技术，检测基因甲基化具有性能好、可靠、快捷、成本低等优势[9-10]。目前，国内外尚无评价 MS-HRM检测患者粪便中基因甲基化筛查大肠肿瘤性能的研究报道。因此，本研究采用MS-HRM技术检测CRC患者、进展期腺瘤（advanced adenomas，AA）患者和正常人粪便DNA中vimentin基因甲基化状态来探讨MS-HRM在CRC筛查中应用的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年9月至2013年1月在南方医科大学南方医院内镜中心行全结肠镜检查并经病理证实的CRC患者27例（CRC组）、AA患者25例（AA组）和30例结肠镜阴性对照者（对照组）的粪便样本。CRC组和AA组纳入标准：（1）年龄大于40岁、病理组织学检查（均由两位经验丰富的胃肠道病理学专家阅片判定）确诊为结直肠AA（指直径大于或等于1cm或组织学检测为绒毛状腺瘤或重度异型性增生的腺瘤）或CRC患者；（2）能收集合格粪便样本的患者。CRC组和AA组排除标准：（1）家族性或遗传性结直肠腺瘤或肿瘤；（2）伴有其他系统或器官肿瘤；（3）CRC或AA患者同时患有炎症性肠病；（4）术前有放疗或化疗史；（5）妊娠或有严重肝肾功能不全者；（6）非原发癌灶者及不能确诊等其他情况。对照组纳入标准：（1）年龄、性别匹配；（2）肠镜检查阴性；（3）收集到合格粪便样本。对照组排除标准：（1）各种原因而未行肠镜检查的；（2）收到的粪便样本不合格。本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 用商品化的粪便留样瓶收集CRC患者、AA患者手术前和正常人新鲜粪便标本约3g，所有粪便标本收集后36h内保存于-80℃冰箱待测。

1.2.2 主要试剂和仪器 QIAamp DNA stool mini kit（50次）和EpiTect HRM PCR Kit（100次）购自德国Qiagen公司；CpGenome Universal Methylated DNA（10μg）和 CpGenome Universal Unmethylated DNA（10μg）购自美国 Millipore公司；EZ DNA Methylation-GoldTMKit（50次）购自美国Zymoresearch公司；MS-HRM检测采用全自动实时荧光定量PCR系统LightCycler480System（罗氏公司）；便隐血检测试纸（胶体金人血红蛋白单抗检测法，万华普曼生物工程有限公司）。

1.2.3 引物设计和合成 根据vimentin基因CpG岛序列，由上海生工公司设计合成引物。vimentin基因的MS-HRM引物序列为，上游：5′-GCG ATG GTT TAG TTG TAA GTT GGT AGT-3′，下游：5′-CTA TCC CGC CGA TTA AAA ACT CCT A-3′，退火温度为63℃，扩增片段长度为126bp。

1.2.4 粪便DNA的提取 按QIAamp DNA stool mini kit（Qiagen）说明书操作。称取粪便约200mg于2mL EP管，加入1.6mL Buffer ASL涡旋混匀1min，使粪便溶解，13 000 r／min离心1min。吸取1.4mL上清液到新的2mL EP管，加入inhibitEX Tablet混匀1min，室温静置1min，吸收杂质，13 000r／min离心3min。吸25μL Proteinase K到新2mL EP管中，加入上清液600μL，Buffer AL 600μL，混匀，70℃温浴10min。加600μL无水乙醇到裂解液，混匀。取吸附柱，加入上述裂解液，13 000r／min离心1min，弃废液。加入500μL的AW1，13 000r／min离心1min，弃废液。加入500μL的AW2，13 000r／min离心3min，弃废液。最后回收DNA，溶于100μL Buffer AE，并保存在-20℃冰箱。DNA浓度和纯度使用NanoDropND-1000UV Spectrophotometer分光光度计测定，DNA质量经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.5 亚硫酸氢盐处理 取500ng DNA样品，按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit（50次，zymoresearch）甲基化修饰试剂盒说明书进行甲基化修饰，修饰时间约为3.5h，修饰后的DNA在24h内进行PCR扩增。

1.2.6 MS-HRM 分 析 PCR 扩 增 和 HRM 在 LightCycler480System一个反应中完成，步骤按EpiTect HRM PCR Kit（100次，Qiagen）说明书进行，所有反应均可重复进行。25 μL反应体系包括：12.5μL 2xEpiTect HRM PCR Master Mix，上下游引物（10μmol／L）各1.9μL，0.2μL亚硫酸氢盐修饰后DNA，8.5μL DEPC水；反应条件如下：95℃15min，然后95℃10s，55℃30s，72℃10s，共45个循环。扩增后HRM步骤，65℃1s，然后按0.02℃／s的速度从65℃升至95℃，每秒钟收集25次荧光。最后40℃冷却1s。使用Gene Scanning Software分析HRM的数据。

1.2.7 粪便潜血试验 按照便隐血检测试纸说明书操作。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计分析，基因频率采用直接计数法，计数资料采用率表示，各组间比较采用χ2检验和Fisher′s精确概率法，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MS-HRM在3组粪便样本中的阳性检出率 粪便中vimentin基因甲基化阳性检出率在CRC组、AA组和对照组中分别为81.5%（22／27），80.0%（20／25）和6.7%（2／30），病例组明显高于对照组（χ2＝42.012，P＜0.05）。其中，CRC组和AA组均明显高于对照组（χ2＝32.629，P＜0.05；χ2＝30.556，P＜0.05），而CRC组和 AA 组间差异无统计学意义（χ2＝0.000，P＞0.05），见图1。

图1 vimentin基因的MS-HRM检测结果。

2.2 FOBT在3组粪便样本中的阳性检出率 FOBT在CRC组、AA组和对照组中的阳性检出率分别为37.0%（10／27）、12.0%（3／25）和3.3%（1／30），病例组明显高于对照组（χ2＝6.308，P＜0.05）。其中，CRC 组明显 高于对 照组（χ2＝10.365，P＜0.05），而 AA 组与对照组间无明显差异（χ2＝0.506，P＞0.05）；CRC组的阳性检出率明显高于 AA组（χ2＝4.340，P＜0.05）。

2.3 MS-HRM和FOBT的诊断性能比较 在病例组中，MSHRM 和FOBT的诊断敏感性分别为80.8%（42／52）和25.0%（13／52），前者显著高于后者（χ2＝32.454，P＜0.05）；在对照组中，两者的诊断特异性分别为93.3%（28／30）和96.7%（29／30），两者之间无明显差异（χ2＝0.000，P＞0.05），见表1。

表1 3组中vimentin基因甲基化状态[n（%）]

3 讨 论

近年来我国CRC发病率呈升高趋势，早期诊断是改善其预后的关键，筛查可以提高早期诊断率。与粪便潜血和肠镜相比，粪便DNA检测具有诸多优势，并被列入美国结直肠癌筛查指南的供选方法。除廉价外，粪便DNA检测几乎继承了粪便潜血检测所有优点，而且具有更好的检测性能，检测CRC的敏感性达52%～91%，特异性达91%～97%[3]；更重要的是腺瘤检出率更高，能有效地降低CRC的发病率。粪便DNA与粪便潜血单独检测AA的敏感性分别是18%和10%（P＜0.05），特异性相当，分别是94%和95%[3]。此外，粪便 DNA只需1次大便采样[5，11-12]；它不受大肠肿瘤部位的影响[13]；DNA来源于大肠局部肿瘤本身，而且癌细胞的脱落量大，加上逃避了细胞凋亡，其DNA仍保持完整，这些都无形中提高了检测的灵敏度[3，5，14]。

在CRC筛查的粪便DNA分子标记中，目前存在着一种以甲基化标记取代基因突变标记的趋势[5]。Bosch等[5]总结近10年关于CRC粪便DNA标记物的研究发现，单个甲基化标记检测能达到与一组基因突变标记相当的性能。以基因突变作为粪便DNA筛查标记，其特异性和敏感性均不能满足CRC筛查的要求，检测CRC的敏感性为25%～73%，检测大肠腺瘤的敏感性为15%～17%，特异性为94%～96%；而以单个基因甲基化为粪便DNA筛查标记，检测CRC敏感性达38%～94%，检测大肠腺瘤的敏感性为31%～70%，特异性为79%～100%[5]。因此，基因甲基化是筛查CRC较理想的生物标记。在众多CRC早期筛查的粪便DNA甲基化标记中，vimentin是研究比较成熟并被充分证实具有很好检测性能的基因[15]。有研究表明，vimentin基因在组织样本中进行甲基化分析，检测CRC和腺瘤的灵敏度分别是53%～83%和50%～84%[12，15]；通过粪便vimentin基因甲基化分析检测 CRC 和AA的敏感性也分别达81%和83%，特异性为82%[16]。然而，目前常用基因甲基化检测技术难以满足便捷、经济、安全高效的大规模筛查要求，急需寻求更理想的检测技术。

MS-HRM是表观遗传学中检测CpG位点的最新技术。它主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，通过比较曲线的熔解温度和峰形，在一系列的CpG位点中，检测出单个甲基化的发生，也可以对平均甲基化水平进行分析，是一种PCR后闭管操作技术，无需序列特异性探针及PCR后继分管处理，具有高通量、无污染、操作简便快捷、灵敏度高、重复性好、成本低、不受检测位点局限等优势[9-10]。有研究发现，MS-HRM检测CRC患者外周血中AKAP12基因启动子甲基化的敏感性为48.0%，特异性为98.0%[7]；检测CRC组织中 MGMT基因甲基化的敏感性为42.4%，特异性为91.0%[8]。这些研究都证实 MS-HRM检测基因甲基化具有性能好、可靠、快捷、成本低等优势。与血液、组织不同，粪便中人DNA含量极低，其平均浓度为100ng／g，大约只占总粪便DNA的0.01%，其他微生物和食物DNA却占99.99%；而且粪便中的人DNA还包括来自正常大肠黏膜的DNA[17]。因此，从粪便中检测人基因甲基化对检测技术要求更高。

本研究应用MS-HRM技术检测粪便中vimentin基因的甲基化状态来筛查大肠肿瘤，在CRC和AA组中的诊断敏感性分别为81.5%和80.0%，在对照组中的诊断特异性为93.3%，诊断敏感性和特异性都在目前国外研究报道的范围内（CRC和AA诊断敏感性分别为38.0%～86.0%和15.0%～83.0%，诊断特异性为73.0%～100.0%）[5，12，16]，且比较理想。FOBT具有操作简便、价格低廉、非侵入性等优点，是目前筛查CRC最常用的方法，但它敏感性和特异性欠佳。本研究中FOBT对CRC和AA的诊断敏感性分别为37.5%和12.0%，这与国外相关研究报道相近[3]，却明显低于笔者用 MS-HRM检测基因甲基化对CRC和AA的诊断敏感性。两种方法的特异性无明显差异。研究已经证实，绝大多数CRC是从癌前病变演变而来，遵循“早期腺瘤-进展期腺瘤-癌”的癌变模式[18]。对腺瘤尤其是AA进行检测并及时处理，不仅可以降低CRC的病死率，还可以降低其发病率，因此，腺瘤才是预防筛查的真正目标。但是目前最常用的CRC筛查方法FOBT对腺瘤的检出率太低[3，13]，对CRC的发病率影响较小。本试验FOBT在AA组中的阳性率也只有12.0%，与对照组无明显差异。而MS-HRM技术对AA的检出率却能达到80.0%，与CRC的检出率相近。此外，FOBT还易受饮食及痔疮、炎症性肠病等其他疾病的影响，而MS-HRM方法不受饮食影响。显然，应用MS-HRM检测粪便中基因甲基化有望取代FOBT而作为CRC筛查的手段。

然而，研究发现vimentin基因并不只是在大肠肿瘤中发生甲基化，它还与很多肿瘤的发生、发展及预后相关，比如乳腺癌等[19]。更重要的是它在上消化道肿瘤中也有很高的检出率，甚至可以作为筛查上消化道肿瘤的生物标记[20]。因此还需要对通过vimentin基因甲基化检测筛查出来的CRC患者进行肠镜等其他检查方法以进一步确诊。和FOBT结果受其他疾病影响一样，这并不影响对应用MS-HRM技术来筛查CRC的性能评估。

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