两种砂梨果实香气成分分析及其相关基因PpAAT的克隆与表达分析

冯立国,巴金磊,韦军,孟祥毅,生利霞

扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009



两种砂梨果实香气成分分析及其相关基因PpAAT的克隆与表达分析

冯立国,巴金磊,韦军,孟祥毅,生利霞*

扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009

摘要:梨（Pyrus spp）是深受国内外消费者喜爱的水果，果实香气是果实品质的重要指标，也是吸引消费者和增强市场竞争力的主要因素之一。本文以砂梨品种‘二十世纪’及其芽变品种‘金二十世纪’为试材，研究了其果实不同发育时期香气成分的差异，克隆获得了梨果实香气成分合成相关的醇酰基转移酶基因（PpAAT），分析了该基因在梨果实不同发育时期及不同部位中的时空表达规律，结果表明：‘二十世纪’绿熟期、商熟期和完熟期果实的主要香气成分均为己醛，‘金二十世纪’绿熟期果实的主要香气成分同样是己醛，但商熟期果实中己酸乙酯的含量迅速增加，成为主要香气成分，完熟期时含量进一步增加，高含量的酯类化合物可能是‘金二十世纪’具有浓郁香气的主要原因；随着果实的成熟，PpAAT基因在‘金二十世纪’果皮中的表达量呈逐渐下降的趋势，绿熟期表达量最高，商熟期表达量开始降低，完熟期表达量非常弱；PpAAT在果肉中的表达量呈先升高后降低的趋势，在商熟期果肉中表达量最高，绿熟期果肉中次之，完熟期果肉中的表达量最低。总体上，PpAAT基因在商熟期的表达量高于绿熟期和完熟期，在果皮中的表达量高于果肉。

关键词:砂梨;果实香气;醇酰基转移酶基因;克隆与表达

梨（Pyrus spp）是世界上广泛栽培的重要果品之一，果实多汁，味甜肉脆，富含VC和多种对人体有益的微量元素[1,2]，深受国内外消费者喜爱。当前，随着消费者对梨果实品质的要求不断提高，品质竞争日渐激烈，果品生产由数量型转向质量型。梨果实的内在品质主要决定于果实风味、肉质、香气等方面，薄壁细胞、石细胞、矿质元素、糖、酸、香气是评价梨果实品质的几个重要指标[3]。果实香气主要来源于是果实中各种微量的挥发性物质，它们对果品的风味起着重要的作用[4]，是构成果品加工和鲜食的主要因素[5-10]，也是吸引消费者和增强果品市场竞争力的主要因素之一。

梨种质资源极为丰富，砂梨（P. pyrifalia）是原产中国南方和日本的梨栽培种之一，近几十年来，中国、日本、韩国先后育成了一大批优良的砂梨品种，其果实硕大，肉质细嫩，果实颜色和成熟期多样，内在和外观品质优良，但其果实香气清淡，香气品质欠佳。因此，充分利用国内外丰富的砂梨种质资源，寻找和挖掘果实香气浓郁的砂梨资源，弄清其特异香气成分及含量，并进而研究它们在梨果实中的代谢与调节机制是一项具有重要价值的研究课题，将为香气浓郁的砂梨品种选育提供重要基础。

目前，有关砂梨果实香气的研究得到了越来越多学者的关注，但主要集中在不同品种、不同成熟期果实香气成分分析及香气形成与代谢关键酶活性的研究方面[1, 5-7]，分子水平的研究较少。‘金二十世纪’梨是日本育种家西田光夫通过对砂梨品种‘二十世纪’进行辐射诱变成选育出的芽变品种，与‘二十世纪’相比，其果皮在商熟期之前呈淡黄绿色，但完熟期变为乳黄色，品质上乘，且具有浓郁的香气，是研究砂梨果实香气的极佳试验材料。本研究首先测定‘二十世纪’和‘金二十世纪’不同发育时期果实香气成分的差异，明确导致‘金二十世纪’果香浓郁的特异香气成分，然后结合该特异香气成分的生物合成途径，克隆与其特异香气成分生物合成相关的PpAAT基因，分析了该基因在其不同果实发育时期和果实不同部位的时空表达规律，旨在为梨果实香气品质的遗传改良奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

砂梨品种‘二十世纪’和‘金二十世纪’种植于扬州大学教学果园，土壤为壤土，微碱性。树龄10年，株行距3 m×4 m，双层棚架栽培，上层架面高度1.7 m，下层架面高度0.9 m，树势中庸，长势一致，肥水等管理水平较好。根据果实发育时期和成熟程度，分别在绿熟期（7月25日，花后115 d）、商熟期（8月18日，花后138 d）和完熟期（8月30日，花后150 d）采摘果实。每个品种随机选择3株，每株随机采摘3个表面完好、无病虫害、成熟度一致的果实，采摘后置于冰盒中运至实验室，立即开始果实香气成分分析。

采摘商熟期‘金二十世纪’果实3个，冰盒带回实验室，四分法去皮去核后，迅速切成小块，液氮研磨后后置于-80℃超低温冰箱保存，用于PpAAT基因的克隆。

分别在绿熟期、商熟期和完熟期采摘‘金二十世纪’果实用于PpAAT基因的时空表达分析。随机选择3株，每株随机采摘3个健康果实，将每株的果实迅速分为果皮和果肉两个部分，分别混匀，液氮迅速研磨后后置于-80℃冰箱中保存备用，单株重复。

1.2试验方法

1.2.1香气成分萃取与分析测样前先将固相微萃取头在气相色谱进样口老化20 min，老化温度250℃。采用四分法将3个果实去除果核后，切碎，混匀，称量样品25 g放入榨汁机压榨。取新榨梨匀浆8 mL于100 mL的样品瓶内，加入6.0 g NaCI（使香气成分充分挥发），并用铝箔纸及进口封口膜密封，将老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，于40℃（水浴）条件下吸附40 min。

吸附完成后将固相微萃取头抽回，插入气相色谱-质谱联用仪（Trace DSQ,美国Thermo公司），于250℃解吸2 min，启动仪器采集数据。色谱条件: FFAP弹性石英毛细管色谱柱，长60 m，内径0. 32 mm，液膜厚1.0 μm；载气为He (99. 99% )，不分流；程序升温，进样口250℃，柱温起始温度50℃保持1 min，以5℃/min升温至120℃，再以8℃/min升温至200℃，最后以12℃/min升温至250℃保持7 min。质谱条件: GC-MS接口温度250℃，离子源温度200℃，电离方式EI，电子能量70 eV，发射电流200 μA；扫描质量范围29~600 amu。各组分经过计算机NIST2.0质谱数据库检索及资料分析，通过峰面积归一化法计算相对含量。三次重复。

1.2.2基因克隆与表达分析

1.2.2.1总RNA的提取与纯化总RNA的提取参照本实验室已建立的改良CTAB法进行。总RNA的纯化采用DNaseⅠ试剂盒，具体操作参照其说明书进行。

1.2.2.2引物设计与扩增根据GenBank中其它植物AAT基因序列的保守区域，运用DNAMAN软件设计引物用于3′端的扩增，根据所得到的3′端序列设计5′端扩增引物，扩增获得PpAAT基因全长，并设计用于表达分析的基因特异性引物。Actin参照鸭梨肌动蛋白基因（表1）。PpAAT基因扩增反应参照3′-Full RACE Core Set Kit和5′-Full RACE Core Set Kit说明书进行。基因表达分析采用半定量PCR（RT-PCR）技术，具体参照陈陈[8]的方法进行。三次重复。

表1　用于梨PpAAT基因扩增和表达分析的引物Table 1 Primers used for isolation and expression analysis of PpAAT gene in pear

1.2.2.3序列分析利用DNAMAN 5.0软件进行全长cDNA序列分析；利用GenBank BLAST进行氨基酸序列的同源性分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。

2　结果与分析

2.1‘二十世纪’和‘金二十世纪’不同发育时期果实香气成分分析

GC-MS分析结果表明（表2），‘二十世纪’绿熟期、商熟期和完熟期分别检出22种、19种和17种香气成分，‘金二十世纪’绿熟期、‘商熟期、完熟期的果实中分别鉴定出13种、18种和20种香气成分。

表2　‘二十世纪’与‘金二十世纪’不同发育时期果实的香气成分及其相对含量Table2Thevolatilecompoundsandtheirrelativeamountsof‘Ershishiji’and‘Jinershishiji’pearindifferentdevelopmentalstages

-未检测到- Not detected.

绿熟期，‘二十世纪’和‘金二十世纪’果实挥发性成分中醛类含量最高，其相对含量分别达到了62.98%和74.56%，含量最多的香气成分是己醛，相对含量分别为37.73%和59.77%。

商熟期，‘二十世纪’醛类含量最高，其相对含量达到了48.26%，是主要香气成分。含量最多的香气成分是己醛，相对含量为20.78%，(4z)-4-乙酸己烯酯和壬醛的含量也较高，占芳香物质总量12.55%和13.93%。而‘金二十世纪’商熟期酯类含量最高，其相对含量达到了82.86%，是主要香气成分，含量最多的香气成分是己酸乙酯，相对含量为54.58%。

‘二十世纪’完熟期仍然是醛类含量最高，相对含量达到了72.53%。含量最多的香气成分是己醛，相对含量为54.33%，乙酸乙酯的含量也较高，占芳香物质总量15.34%。而‘金二十世纪’完熟期酯类含量最高，其相对含量达到了90.12%，含量最多的香气成分是己酸乙酯，相对含量为70.53%。

综合分析发现，‘二十世纪’绿熟期、商熟期和完熟期果实的主要香气成分均为己醛，‘金二十世纪’绿熟期果实的主要香气成分同样是己醛，但商熟期果实中己酸乙酯的含量迅速增加，成为主要香气成分，完熟期时含量进一步增加，达70.53%，这可能也是其具有浓郁香气的主要原因。

2.2‘金二十世纪’果实特异香气相关PpAAT基因的克隆与序列分析

以‘金二十世纪’梨果实中所提取的RNA为模板，采用RACE方法进行3′和5′端cDNA片段的扩增，得到PpAAT基因cDNA全长序列。该cDNA全长1648 bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框（1316 bp）、5′非编码区（79 bp）、终止密码子、3′非编码区（242 bp）和poly(A)尾巴（11 bp），共编码473个氨基酸。该基因登录号为KF887152，并将其命名为PpAAT（图1）。

图1　梨PpAAT基因核酸序列及推断的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of PpAAT gene of pear

通过NCBI同源性搜索，并绘制同源树（图2），显示该基因序列与苹果（AY512893.1）、枇杷（KF704125.1）、杏（EU784138.1）、橙（NM_001288910.1）等植物AAT基因核苷酸序列的同源性分别达96%、95%、71%、67%，推导出来，该基因的氨基酸序列与苹果（AGW30203.1）、枇杷（AHC32224.1）、橙（NP_001275839.1）、草莓（AEM43830.1）等植物AAT基因氨基酸序列的同源性分别达94%、91%、57%、62%。

图2　梨PpAAT基因氨基酸序列与其他植物同源序列的同源树Fig.2 Amino acid sequence of PpAAT gene and other plants in homology tree

2.3PpAAT在‘金二十世纪’梨果实不同发育时期及不同部位中的表达分析

如图3所示，随着果实的成熟，PpAAT基因在果皮中的表达量呈逐渐下降的趋势，绿熟期（A）表达量最高，商熟期（C）表达量开始降低，完熟期（E）表达量非常弱。同样分析发现，PpAAT在果肉中的表达量呈先升高后降低的趋势，在商熟期果肉（D）中表达量最高，绿熟期果肉（B）中次之，完熟期果肉（F）中的表达量最低。总体来看，PpAAT基因在商熟期的表达量高于绿熟期和完熟期，在果皮中的表达量高于果肉。

图3　不同发育时期及不同部位‘金二十世纪’果实中PpAAT基因的半定量表达水平Fig.3 Expression level of PpAAT gene in different developmental stages and different part of pear by RT-PCR

3　讨论

味感物质（糖、酸等）和嗅感物质（香味物质）构成果实的风味物质或果实风味复合物，其组成及质量分数对果实内在品质有重要影响[9,10]。前人研究表明，砂梨果实的主要香气成分为己醛和2-己烯醛[1,5]，而醛类化合物在感官上是清香型果香，香气淡。本研究表明，‘金二十世纪’绿熟期果实的主要香气成分同样为己醛，但商熟期之后，其果实中己酸乙酯等酯类化合物的相对含量迅速增加，成为主要香气成分。酯类化合物是具有愉悦的浓香型果香的一类化合物，因此，高含量的酯类化合物可能是‘金二十世纪’具有浓郁香气的主要原因。

研究表明，酯类挥发性成分作为果实特征香气中最重要的组分之一，多种酶参与了其代谢的调控。酯类物质是以脂肪酸[11]和特定氨基酸[12,13]为前体代谢产生的。脂肪酸通过β-氧化过程产生乙酸、丁酸和己酸，然后还原为相应的醇类，这些醇在酰基CoA存在的情况下，通过醇酰基转移酶（AAT）的作用酯化为酯[14]，醇酰基转移酶（AAT）基因是该途径最后一步的关键基因。为此，本研究采用RACE方法从酯香浓郁的‘金二十世纪’梨果实中克隆获得了PpAAT基因，并研究了其在梨果实不同发育时期及不同部位中的时空表达规律，发现pAAT基因在商熟期和绿熟期的表达量较高，但在完熟期开始迅速降低。香气检测数据结果显示（表2），‘金二十世纪’在绿熟期、商熟期和完熟期酯类物质相对含量分别为15.79%、82.86%和90.12%，即从绿熟期到完熟期时酯类化合物含量逐渐上升，其变化趋势与PpAAT表达量的变化不完全同步，究其原因，可能是由于PpAAT基因从绿熟期到商熟期表达逐渐较强，促进了乙酸己酯、己酸乙酯等酯类物质在此期间不断形成和积累，至完熟期时酯类物质积累量达到最高。但随着果实成熟进程推进，酯类物质合成前体不断消耗，最终导致PpAAT基因的表达量在完熟期时降至最低。但有关AAT酶活性变化与PpAAT基因表达之间的因果关系尚待进一步研究。

参考文献

[1]田长平,魏景利,刘晓静,等.梨不同品种果实香气成分的GC-MS分析[J].果树学报,2009,26(3):294-299

[2]纵伟,赵光远,张文叶,等.水晶梨中香气成分的GC-MS分析[J].食品研究与开发,2006,27(10):105-106

[3]张喜焕,陈敬宜,辛贺明,等.近年我国梨果实内在品质研究进展[J].邯郸农业高等专科学校学报,1999,16(2):22-26

[4]赵胜亭,齐伟,徐顺利.烟台富士苹果香气成分的气相色谱质谱测定[J].安徽农业科学,2005,33(4):632-633

[5]秦改花,张虎平,陶书田,等.早熟梨果实不同成熟阶段的香气组成[J].食品科学,2012,33(6):220-224

[6]廖凤玲,汪志辉,熊博,等.爱甘水梨果实发育过程香气形成与代谢关键酶活性的关系[J].华北农学报,2014,29(2):152-155

[7]涂俊凡,秦仲麒,李先明,等.砂梨和库尔勒香梨果实香气物质的GC-MS分析[J].湖北农业科学,2011,50(15):3186-3190

[8]陈陈.玫瑰花香成分生物合成相关基因的克隆与表达分析[D].扬州:扬州大学,2012

[9]陈美霞,陈学森,周杰,等.杏果实不同发育阶段的香味组分及其变化[J].中国农业科学,2005,38(6):1244-1249

[10] Dandekar AM, Teo G, Defilippi BG, et al. Effect of down- regulation of ethylene biosynthesis on fruit flavor complex inapple fruit[J]. Transgenic Research, 2004,13:373-384

[11] Rowan DD, Allen JM, Fielder S, et al. Biosynthesis of straight-chain ester volatiles in red delicious and granny smith apples using deuterium-labeled precursors[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999,47:2553-2562

[12] Hansen K, Poll L. Conversion of L-isoleucine into 2-methylbut-2-enyl esters in apples[J]. Food Science and Technology, 1993,26(2):178-180

[13] Rowan DD, Lane HP,Allen JM, et al. Biosynthesis of 2-methylbutyl, 2-methyl-2-butenyl, and 2-methylbutanoate esters in red delicious and granny smith apples using deuterium-labeled substrates[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996,44(10):3276-3285

[14] Knee M, Hatfield SGS . The metabolism of alcohols by apple fruit tissue[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1981,32:593-600

Analysis on Aromatic Constituents from Two P. pyrifalia Cultivars and the Cloning and Expression of the relevant PpAAT Gene

FENG Li-guo, BAJin-lei, WEI Jun, MENG Xiang-yi, SHENG Li-xia*

College of Horticulture and Plant Protection/Yangzhou University, Yangzhou 225009, China

Abstract:Pyrus spp is a very popular fruit in the world. Fruit aroma is an important index of fruit quality, it is also a main factor of attracting consumers and strengthening market competitiveness. In this paper, the volatile compounds of the fruit of P. pyrifalia‘Er shi shi ji’and P. pyrifalia‘Jin er shi shi ji’in different developmental stages (green stage, commercial stage and ripe stage) were studied by GC-MS. Then the full sequence of alcohol acyltransferase (PpAAT) gene which related to the biosynthesis of aromatic compounds in pear were cloned by RACE method, and the expression patterns of PpAAT gene in different developmental stages and different organs of pear fruits were analyzed by RT-PCR. The results showed that hexanal was the main aromatic compounds of‘Er shi shi ji’in 3 different mature stages of fruit, so the green stage of‘Jin er shi shi ji’, but ethyl caproate became the main aromatic compounds of‘Jin er shi shi ji’in commercial stage, and its amount further increased in the full ripe stage. The high amounts of esters may be the main reason for the rich aroma of‘Jin er shi shi ji’; We also found that the expression level of PpAAT gene gradually declined along with fruit riping in pear pericarp of‘Jin er shi shi ji’, which reached the highest level in the green stage, and started to drop from the commercial stage, then dropped rapidly at ripe stage. The expression level of PpAAT gene in pear sarcocarp firstly increased from green stage to commercial stage, and then dropped rapidly in ripe stage. As a whole, the expression level of PpAAT gene in commercial stage was higher than which in the other two stages, and it was also higher in the pericarp than in the sarcocarp.

Keywords:Pear fruit; aromatic constituents; alcohol acyltransferase; cloning and gene expression

*通讯作者:Author for correspondence. E-mail:lxsheng@yzu.edu.cn

作者简介:冯立国(1979-),男,博士,副教授,硕士生导师,主要从事园艺植物种质资源与生物技术研究. E-mail:lgfeng@yzu.edu.cn

基金项目:江苏省林业三新工程项目(LYSX[2014]43)

收稿日期:2015-05-14修回日期: 2015-05-25

中图法分类号:S661.2

文献标识码:A

文章编号:1000-2324(2015)04-0491-06