欧洲黑杨‘N46’组培再生体系的建立1)

王颜波 常英英 梁立雄 苏晓华 张冰玉 杨帆 刘秀华 王建革

(江西农业大学，南昌，330045) (林木遗传育种国家重点实验室(中国林业科学研究院林业研究所)) (江西农业大学)

责任编辑:潘 华。

稳定高效的再生体系是遗传转化的重要前提。杨树是我国重要的栽培树种，在世界上也占有重要地位。一般说来，白杨派树种的组培再生体系已经较为成熟，黑杨派树种则相对较为困难。近年来，黑杨派树种的再生及遗传转化已在国内外科学家的努力下取得了巨大进步［1-5］。于志水等［6］探索了黑杨派树种组培体系，通过不同外植体分化得到无菌苗，并且筛选了培养基配方，得到了继代和生根苗。康薇等人［7］筛选出了美洲黑杨(Populus deltoides)离体叶片分化和生根的最适培养基，建立了组培再生体系。周洲［8］等人采用蛭石为基质，使欧美杨108(Populus × euramericana)、欧美杨2001(Populus ×euramericana)、欧美杨107(Populus ×euramericana)生根，并显著提高生根苗继代培养和移栽成活率。崔旭东等［9］还发现卡那霉素可以抑制渤丰1 号杨(Populus×euramericana cl.‘Bofeng 1’)叶片的诱导与分化，增加Cu2+质量浓度能显著促进渤丰1 号杨不定芽的诱导和分化。

在杨树育种资源中，黑杨派树种是重要基因供体。本研究以欧洲黑杨N46 无性系的腋芽无菌萌发的幼嫩叶片为试验材料，研究了不同激素组合配比、培养温度等因素对不定芽诱导和生根的影响，建立了无性系的再生体系，为杨树快速繁育和遗传改良提供借鉴。

1 材料与方法

2014年4月自中国林业科学研究院科研温室中采取生长健壮无病的1年生欧洲黑杨N46 无性系含腋芽的茎段，消毒后在MS 培养基中培养，取腋芽无菌萌发的幼嫩叶片作为试验材料。

取含腋芽的茎段，流水冲洗2 h，75%乙醇处理1 min;接着用含0.02% tween-20 的2% NaClO 液中处理10 min，最后用无菌水冲洗4 次。接种于不加任何激素的MS 培养基上进行培养。

最适分化培养基的选择:待MS 培养基上茎段上的腋芽萌发至3～4 cm 时，取生长健壮的腋芽自上而下第3、4 个叶片，切去边缘，正面朝下平铺于分化培养基上。培养基成份采用正交设计4 因素3 水平L9(34)表设计，共9 个处理，每个处理接种10 个无菌叶片，3 次重复。暗培养48 h 后，转到光下培养。光照强度2 300 lx，光周期16 h/8 h。每7 d 观察1 次，培养21 d 后统计不定芽的分化情况。

最适生根培养基的选择:选取生长健壮且长度大于1 cm 的不定芽接种在生根培养基上，培养基成份采用正交设计4 因素3 水平L9(34)表设计，共9个处理，每处理10 个不定芽，3 次重复。7 d 后每天观察1 次，第15 d 统计不定芽的生根情况。

再生苗的移植:当组培苗高度达10 cm 时，在自然条件下封口炼苗3 d，之后用镊子将苗小心取出，然后用清水洗去根部培养基，用1.5%多菌灵溶液浸泡1 min，再将其移植到拌有1.5%多菌灵溶液的V(草炭土)∶ V(珍珠岩)=5∶ 1 的基质中，浇透水，并用塑料薄膜罩于营养钵上保湿。15 d 后，揭去塑料薄膜进行培养，30 d 后统计成活率。

存活率=(存活的外植体数/接种外植体数)×100%;生根率=(生根的外植体数/接种外植体数)×100%。采用SPSS17.0 对试验观测数据进行处理和统计分析，在F0.05水平上进行差异显著性检验后，用新复极差(SSR)法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 最适分化培养基的选择

叶片接入7 d 后，叶片出现卷曲，叶脉处出现膨大，叶片边缘伤口处出现淡黄色愈伤，个别呈现淡绿色。14 d 后，愈伤组织颜色加深，不定芽开始形成。21 d 后不定芽大量出现，单芽、双芽和丛生芽均有。不同分化培养基对不定芽诱导的结果及多重比较见表1。

表1 不同分化培养基对不定芽诱导的结果

根据表1中Ki(其中一个因素水平号为i 时分化芽数的平均值)值可知，6-BA 质量浓度从0.8下降到0.3 mg·L-1过程中平均分化不定芽数先上升后下降，在6-BA 质量浓度为0.5 mg·L-1时最高;NAA 质量浓度在从0.08 到0.03 mg·L-1过程中平均分化不定芽数呈上升趋势;随着温度的上升，不定芽数先下降后上升，在27 ℃时最高，凝固剂琼脂粉中分化不定芽数略微高于植物凝胶。根据各因素3 个水平的极差R 判断，4 个因素对不定芽诱导的影响程度为A ＞B ＞C ＞D。依据表中的Ki的最大值可知，最适分化培养基为:A2B3C3D2，即MS +6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.03 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+0.5%琼脂粉，最佳诱导温度为27 ℃(见图1)。

2.2 最适生根培养基的选择

不同生根培养基对不定芽生根的影响的结果见表2。将1.5 cm 长左右的不定芽切下，接入生根培养基。在5 d 后开始多数处理出现乳白色根点，8 d后，第7、8、9 处理的根清晰可见，根数在6～10 条不等。15 d 时第9 处理的根长可达4～5 cm，主根明显，须根茂密。

根据表2中ki值可知，IBA 与NAA 质量浓度在从0.1 降到0.01 mg·L-1过程中生根率均呈上升趋势;随着温度的上升，生根率先上升后下降，在25 ℃时最高，凝固剂琼脂粉中生根率略微高于植物凝胶。依据各因素3 个水平的极差R 判断4 个因素的影响程度为A ＞B ＞C ＞D，根据表中的Ki的最大值可知，最佳分化培养基为:A3B3C2D2，即1/2MS +IBA0.01 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 0.5%琼脂粉，最佳生根温度为25 ℃(见图1)。

图1 最佳培养基上不定芽的诱导和生根情况

表2 不同生根培养基对不定芽生根的影响

3 结论与讨论

本研究建立了欧洲黑杨N46 无性系高效稳定的不定芽诱导和植株再生体系:幼嫩叶片进行不定芽分化诱导的最适培养基为MS +6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.03 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂粉5 g·L-1，诱导最佳温度为27 ℃，每个叶片平均分化不定芽数量可达45.20 个;不定芽生根的最佳培养基为1/2MS + IBA0.01 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂粉5 g·L-1，生根最佳温度为25 ℃，生根率可达93.33%，生根小植株移栽成活率达98%。

培养基中激素的种类及配比是影响外植体分化和不定芽诱导的关键因素，调节其水平及配比是建立和优化再生体系的有效手段［10］。有研究认为，培养基中激素的相对含量控制植物不定芽的分化及器官形成，并非其绝对含量［11］。然而一些针对杨属植物不定芽诱导的研究结果迥异，激素的绝对含量相差无几，而相对含量相差甚大。王金贵［12］筛选出的的俄罗斯抗寒杨(Populus alba)不定芽的诱导培养基中6-BA 与NAA 的绝对质量浓度为0.5 mg·L-1和0.2 mg·L-1。崔莉洁［13］等人研究来源于阿塞拜疆共和国巴库地区的欧洲黑杨(Populus nigra)最适的不定芽诱导培养基中6-BA 与IBA 的绝对质量浓度为1 mg·L-1和0.25 mg·L-1。崔旭东［9］研究的欧美杨渤丰1 号分化培养基中6- BA 与NAA 的绝对质量浓度为0.4 mg·L-1和0.04 mg·L-1。本研究中欧洲黑烟N46 最适的分化培养基中6-BA 与NAA 的绝对质量浓度为0.5 mg·L-1和0.03 mg·L-1。激素6-BA 的质量浓度在0.4～1.0 mg·L-1，NAA 的质量浓度在0.03～0.2 mg·L-1，绝对质量浓度相差不大，而相对质量浓度相差悬殊，从2.5 倍到17 倍不等，均取得了良好的分化效果。由此可见，培养基中激素的相对质量浓度和绝对质量浓度均是不定芽诱导的影响因素，其种类及配比因物种而异。

对于不定芽的生根培养基存在不同的观点，均取得了良好的生根效果。洪震［14］等人在研究秀丽野海棠叶片不定芽生根时，使用MS 培养基取得了良好的效果。崔旭东［10］发现渤丰1 号杨在1/2MS的培养基中生根效果最好。任如意［15］使用1/4MS培养基培养药用植物北玄参，生根率达100%，平均生根数为11.33。不过，崔莉洁［13］等人比较欧洲黑杨在1/2MS 与MS 培养基上的生根效果，结果表明1/2MS 培养基生根效率和效果明显优于MS 培养基。金华等［16］人利用741 杨的培养结果支持上述观点。

本研究采用无机离子减半的1/2MS 培养基进行生根培养，不定芽8 d 即可生根，生根率可达93.33%。由此可见，采用无机离子减半的1/2MS培养基更有利于欧洲黑杨生根。再生体系是遗传转化的基础，而遗传转化是培育转基因新品种的有效途径。本研究建立了欧洲黑杨N46 无性系的组培再生体系，为黑杨快速无性繁殖及遗传转化提供了借鉴。

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