MTAD/Nisin抗菌肽联合应用对根管内粪肠球菌杀菌作用的实验研究

何薇薇，安　峰*，乔海霞，王晓明，林维龙(.河北北方学院附属第一医院口腔科，河北 张家口 075000；.河北北方学院检验系，河北 张家口 075000)



·论著·

MTAD/Nisin抗菌肽联合应用对根管内粪肠球菌杀菌作用的实验研究

何薇薇1，安峰1*，乔海霞2，王晓明1，林维龙1(1.河北北方学院附属第一医院口腔科，河北 张家口 075000；2.河北北方学院检验系，河北 张家口 075000)

[摘要]目的观察MTAD联合Nisin抗菌肽等冲洗剂对根管内粪肠球菌的抗菌效果。方法在50颗离体牙上建立粪肠球菌根管内感染模型,培养21 d。分为A、B、C 3个实验组和2个对照组，实验组分别用MTAD/Nisin抗菌肽、5.25%次氯酸钠/17%EDTA、复方氯己定含漱液冲洗。在冲洗前、后分别用吸潮纸尖插入根管内进行细菌取样并培养计数。所有实验样本分别浸泡在各自冲洗液中5 min，用慢钻磨取样本的牙本质碎屑置于BHI琼脂板上培养48 h，记录感染粪肠球菌的样本数量。结果冲洗前各组根管内细菌数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。冲洗后，A、B、C组根管内细菌数量均低于阳性对照组，A组低于B、C组，B组低于C组(P<0.05)。A组感染样本数低于阳性对照组、B组和C组(P<0.05)。结论MTAD联合Nisin较5.25%次氯酸钠/17%EDTA和复方氯已定含漱液对粪肠球菌有更优越的抗菌性能。

[关键词]根管制备；粪肠球菌；根管冲洗剂

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.011

研究显示细菌对牙髓及根尖周疾病的发展有至关重要的影响[1]。现代根管清理术使根管系统中的许多区域不能直接被器械预备[2]。因此，寻找一种能清除根管内细菌且具有持续杀菌效果的根管冲洗液是非常必要的。理想的根管冲洗剂需要具备以下条件[3]:①有广泛的抗菌谱；②对厌氧菌和以生物膜形式存在的兼性厌氧菌有高功效；③能溶解坏死的剩余牙髓组织；④能阻止内毒素的活动；⑤能防止在机械预备中玷污层的形成或者可溶解玷污层；⑥当接触到根尖周组织和牙周组织无毒，极少发生过敏反应。多种不同浓度的次氯酸钠被用作根管冲洗剂,而5.25%次氯酸钠/17%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)更在临床上联合使用，具有很好的抗菌效果。本研究采用新型冲洗剂MTAD联合Nisin对感染粪肠球菌的离体牙进行冲洗，同时用5.25%次氯酸钠/17%EDTA和复方氯己定含漱液行常规对照，以期为临床上寻找既能有效对抗粪肠球菌又具有多种优良性能的冲洗剂。报告如下。

1材料与方法

1.1实验标本选取在河北北方学院附属第一医院口腔门诊新鲜拔除的单根管牙50颗，去除根周软组织、牙石等，清洗干净后置于生理盐水中4 ℃冰箱保存备用，以避免脱水。排除标准：①牙根不完整；②牙根表面存在细小裂纹；③根尖孔未发育；④有龋坏。

1.2实验用冲洗剂配制Nisin冲洗液：称取1.5 g Nisin粉，溶于50 mL蒸馏水中，置于-20 ℃保存备用。MTAD冲洗液：MTAD液与蒸馏水按照1∶4比例稀释后，置于4 ℃保存备用。

1.3制备标准菌液在超净工作台上，将粪肠球菌冰冻液复苏，用移液器取50 μL菌液接种于灭菌的新鲜配制的脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth，BHI)培养基中，5% CO2培养箱(37 ℃)培养2 d。采用革兰染色，经显微镜观察在培养基内粪肠球菌可形成乳脂状的白色菌落。最后用比浑仪将接种了粪肠球菌的BHI调整成浊度为0.5 mol/L的标准菌液。

1.4建立根管感染模型用无菌砂片将实验牙切除牙冠，保留12 mm牙根长度。常规消毒拔髓。预备时采用冠向下法并用机动Protaper器械进行，预备到25号(08锥度),根管预备过程中每更换1次器械，用装有5 mL 0.9% NaCl溶液的注射器配23G侧向开口针头冲洗1 min。预备完成后，用3M树脂封闭根尖部分。然后将所有离体牙放入含有5 mL BHI试管中,121 ℃高温高压下灭菌20 min以达到无菌。随后将其中40颗离体牙分别浸泡在包含粪肠球菌混浊度为1×108CFU/L 的10 mL BHI中，30 min内操作完毕。37 ℃兼性厌氧条件下培养21 d。让粪肠球菌侵入牙本质小管。培养基液每3 d更换1次保持细菌水平。从40颗离体牙中随机抽取10颗用无菌吸潮纸尖从根管内部取样，然后接种于BHI血琼脂平皿上，以证实感染。体外根管感染模型建立成功。

1.5实验分组阴性对照组10颗离体牙不感染细菌。经过3周培养的体外根管感染模型40颗牙，分为阳性对照组和A、B、C 3个实验组。冲洗方案见表1。

表1　冲洗方案

1.6冲洗及细菌培养所有过程均采用无菌操作，使用无菌手套、镊子、K锉、吸潮纸尖等。

1.6.1第1次取样(N1)冲洗前用25号无菌吸潮纸尖按照记录的工作长度插入根管内停留1 min，吸取根管内液后，立即放入装有100 μL生理盐水的Eppendorf管中混匀，10倍系列稀释，分别接种于BHI血琼脂平皿上，37 ℃下CO2孵育箱中培养，48 h后计数菌落数(CFU/mL)，记为N1。

1.6.2第2次取样(N2)用手动不锈钢K锉继续预备离体牙至40号，每更换1次器械时分别用冲洗液进行根管冲洗。A组先用5 mL Nisin冲洗液后再使用5 mL MTAD冲洗液冲洗；B组先用5 mL 17%EDTA再使用5 mL 5.25%次氯酸钠冲洗；C组使用10 mL复方氯己定含漱液冲洗。然后所有样本用2 mL蒸馏水冲洗根管，无菌镊子夹持30号吸潮纸尖按照记录的工作长度插入根管内停留1 min，吸取根管内液，放入装有100 μL生理盐水的Eppendorf管中，10倍系列稀释，送培养计数，记为N2。

1.6.3细菌培养冲洗完成后，将每组离体牙分别浸泡在各自冲洗液内5 min。然后用无菌慢球钻磨除离体牙根管内壁的牙本质碎屑，并置于BHI琼脂板上培养48 h，记录每组有粪肠球菌存在的样本数量。

1.7统计学方法应用SPSS 19.0统计软件处理数据。计量资料比较分别采用F检验、q检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

在所有阳性对照组中浑浊度明显，说明在整个实验过程中样本中粪肠球菌的感染一直存在；而在阴性对照组中无1例浑浊，说明在整个操作过程中严格执行了无菌操作，无交叉感染。冲洗前各组根管内细菌数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。经过冲洗剂的冲洗，A、B、C组根管内细菌数量均低于阳性对照组，A组低于B、C组，B组低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。A组感染粪肠球菌牙数低于阳性对照组、B组和C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，3。

表2　各组冲洗前后根管内细菌数量比较

*P<0.05与阳性对照组比较#P<0.05与A组比较△P<0.05与B组比较(q检验)

表3　各组冲洗剂浸泡后感染粪肠球菌牙数比较

*P<0.05与阳性对照组比较#P<0.05与A组比较(χ2检验)

3讨论

有学者认为细菌侵入牙本质小管时并不是一个主动过程,它是随着液体成分在牙本质小管中的渗入进入牙本质小管的，粪肠球菌的直径为0.5～1.0 μm，而牙本质小管的直径为1～4 μm,所以粪肠球菌相对大多数细菌更易进入牙本质小管[4]。在根管治疗失败的病例中粪肠球菌检出率很高，当外界环境允许时，存在于牙本质小管内的粪肠球菌可移动到根管内使患牙形成再感染。所以本研究在体外建立粪肠球菌离体牙感染模型，进行根管预备，并用冲洗剂冲洗根管，模拟临床操作过程，以比较不同冲洗剂对粪肠球菌的抗菌作用。

次氯酸钠在医学和牙科学应用中具有悠久的历史，次氯酸钠的主要优势是对坏死组织的溶解能力及对大多数微生物的抗菌性能强大，弊端是气味难闻、高毒性、不能去除玷污层[5]。次氯酸钠的杀菌能力受pH值、温度等的影响。EDTA几乎无抗菌能力，但可通过影响牙本质的无机成分有效去除玷污层，临床上经常与次氯酸钠联合使用冲洗根管[2]。MTAD是由有广谱抗菌作用的3%多西环素、可去除矿物质的4.25%柠檬酸和0.5%聚山梨醇酯80清洁剂组成的水溶液[6]。Cicek等[7]已证实，MTAD的牙本质脱矿能力较17%EDTA优越，使亲水性封闭剂等更有效渗透入牙本质层并形成良好的机械嵌合力。Nisin抗菌肽，又称为乳球菌肽或乳链菌肽，是由乳酸链球菌和乳酸乳球菌在代谢过程中合成、分泌的具有很强杀菌作用的天然生物活性抗菌肽。对很多G+菌具有抑菌活性，包括多重耐药的G+致病菌；在络合剂联合作用下对G-菌有一定抑制作用[8]。Tong等[9]发现经过Nisin处理后G+菌中的氨基酸、三磷酸腺苷等快速流失，其抗菌机制可能是通过干扰细菌胞膜结构。氯己定生物相容性好，临床上多制成含漱液，用于咽峡炎、口腔炎、牙龈炎的辅助治疗。氯己定具有广谱抗菌性，对G+、G-及酵母菌有一定的抑菌效应，虽然它可以吸附在细菌胞浆膜的渗透屏障，使细胞内容物漏出，低浓度时呈抑菌作用，但其对这些细菌的抗菌效果并不显著[10]。

本研究采用平板计数法进行菌落计数，结果显示通过常规冲洗，各组冲洗剂均不能完全杀灭根管内的粪肠球菌；但将实验组样本在各自冲洗剂浸泡5 min后，MTAD联合Nisin组10例样本中无1例感染粪肠球菌，表现出极强的杀灭粪肠球菌的性能；而其他2个实验组分别有10例、9例样本感染。Tong等[8]证实，当MTAD中的多西环素和Nisin 联合应用时，Nisin 对细菌胞膜形成的孔洞可以有利于多西环素分子进入到细菌胞内，更好地发挥抗菌作用。且MTAD液呈酸性，Nisin在酸性环境中具有更好的抗菌性和稳定性[11]。已有研究证实MTAD联合Nisin抗菌肽对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌、内氏放线菌等有明显的抗菌效果[8]。体外研究证实MTAD稀释200倍仍对粪肠球菌有很高的敏感性，而次氯酸钠稀释32倍以上即不具备抗菌作用[12]。Davis等[13]体外试验显示2%洗必泰和5.25%次氯酸钠对粪肠球菌的抗菌性能均低于MTAD。与先前报道的研究相符[12,14-15]。然而，本研究结果与之相反。有学者研究发现MTAD和5.25%次氯酸钠对感染粪肠球菌的根尖5 mm区域有抗菌性能[15]。这些不同的研究结果使MTAD的抗菌效果存有争议，虽然可能在某些程度上是因为方法的不同(如选择微生物的取样步骤或者冲洗剂配比)造成的误差；而本研究中虽然通过常规冲洗MTAD联合Nisin抗菌肽并不能完全杀灭粪肠球菌，但通过延长冲洗剂作用根管的时间后MTAD联合Nisin对与持续性根管感染有关的粪肠球菌的杀菌作用很显著。此外，本实验选取的牙齿为单根管的离体牙，根管系统相对简单，所以根管冲洗剂对于复杂根管系统的消毒效果还有待研究。尽管MTAD冲洗液已开始在临床上应用，但其在患者口腔内的抗菌效果还需要进一步的研究证实。MTAD联合Nisin用于根管冲洗目前还只限于离体牙的研究，这种药物联合能否有效地根除根管内的致病菌尚需在临床中进一步检测。

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(本文编辑：赵丽洁)

In vitro evaluation of antibacterial activities of MTAD/Nisin against Enterococcus faecalis

HE Wei-wei1,AN Feng1*,QIAO Hai-xia2,WANG Xiao-ming1,LIN Wei-long1

(1.Department of Dentistry,the First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China;2.Department of Laboratory,Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China)

[Abstract]ObjectiveThe in vitro study was to assess the antimicrobial efficacy of different irrigants such as MTAD/Nisin against E.faecalis in contaminated root canals.MethodsFifty single rooted extracted human teeth were inoculated with E.faecalis and incubated for 21 days.The samples were divided in two control groups and three experimental groups irrigated with MTAD/Nisin; 5.25% NaClO/17%EDTA and compound chlorhexidine gargle.The bacteria samples were collected with sterile paper points before and after the instrumentation.After washing,the samples of experimental groups immersed in MTAD/Nisin,5.25% NaClO/17%EDTA and compound chlorhexidine gargle for five minutes.Dentin shavings were taken with slow drilling.Shavings were collected on BHI agar plates and incubated for 48 hours.Then,we recorded number of samples with E. faecalis.ResultsThe bacterial culture counts of different groups before rinsing showed no significant difference in the number of bacteria in the root canal(P>0.05).After washing,A,B and C group were lower than the positive control group；A group was less than B,C group；B group was less than C group(P<0.05).The number of samples infection in A group was lower than positive control group,B group and C group(P<0.05).ConclusionThese findings suggest that MTAD/Nisin possesses superior bactericidal activity compared with 5.25% NaClO/17%EDTA,compound chlorhexidine gargle against E.faecalis.

[Key words]root canal preparation；enterococcus faecalis；root canal irrigants

[中图分类号]R781.3

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)12-1404-04

[作者简介]何薇薇(1980-)，女，辽宁本溪人，河北北方学院附*通讯作者。E-mail：kq126@126.com

[基金项目]张家口市科学技术研究与发展指导计划(1321114D)

[收稿日期]2015-07-08；[修回日期]2015-08-07

属第一医院主治医师，医学硕士，从事口腔疾病诊治研究。