3′-U3区碱基突变不影响禽白血病病毒的体外复制能力

高雁怩，高 奇，李晓菲，贠炳岭，祁小乐，王永强，刘长军，崔红玉，张艳萍，高宏雷，王笑梅，高玉龙

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽免疫抑制病创新团队，哈尔滨150001）

禽白血病病毒属于反转录病毒科，禽C型反转录病毒属，俗称禽C型肿瘤病毒。根据病毒的宿主范围、囊膜特性、交叉中和试验及其他特性，可将禽白血病病毒分为6个亚群，即A、B、C、D、E和J亚群禽白血病病毒。同时，根据传播方式的不同，禽白血病病毒也可分为外源性白血病病毒（A、B、C、D和J亚群）和内源性白血病病毒（E亚群）。J亚群禽白血病病毒（J subgroup avian leukosis virus，ALV-J）是在1988年由英国科学家L.N.Payne于肉用型鸡群中首次分离得到［1］，此后ALV-J在世界范围内流行，给世界养禽业带来了巨大的经济损失。中国于1999年首先在肉鸡中分离出ALV-J，随后在2004年首次报道蛋鸡自然感染ALV-J［2-3］。

在2004年以前，中国的ALV-J感染主要在肉鸡中流行，但自2004年后，在蛋鸡以及多种地方品系鸡中也发现了ALV-J的自然感染病例并分离得到病毒［4-5］，特别是2009年后，该病在蛋鸡群中的影响进一步扩大。有报道称ALV-J感染蛋种鸡群后可引起高达60%的发病率和最多超过20%的死亡率。同时，ALV-J的感染还引起了多种肿瘤的发生，并在全国范围内引起商品化蛋鸡和地方种鸡的生产下降等问题［2，6-7］。

ALV-J具有典型慢转化复制完全型白血病病毒的整体结构，即5′-LTR-gag-pol-env-3′LTR［8］。其LTR区域是病毒复制过程的重要调节区域，在病毒的翻译和RNA的复制过程中起着重要的作用。LTR由U3-R-U5三部分组成，其中U3的作用最为重要。U3区含有多种顺势作用元件，如CCAAT增强子结合元件等，可与细胞内反式作用因子结合，进而调控病毒的复制，转录等重要生命过程。gag、pol和env基因则分别编码ALV-J的衣壳蛋白、反转录酶及囊膜蛋白。

近几年，ALV-J的流行毒株与其原型毒株HPRS-103的基因组序列比较显示，ALV-J的流行毒株的基因组序列出现一些与其致病性密切相关的特征性突变。例如，其r TM缺失205个碱基，E元件序列的缺失都是ALV-J在其进化过程中自然发生的序列突变，并且某些这类突变能够增强病毒本身的致病力［10-11］。最近，本实验室经过分析ALV-J蛋鸡分离株的序列特点，在其U3区域发现了很多特异性且有规律的突变［7，11］。为了验证这些特异性的突变是否能够对病毒的生物学特性造成影响，我们构建了ALV-J的原型毒株HPRS-103的感染性克隆，同时构建了以HPRS-103原型毒株为骨架，替换上具有特征性突变的蛋鸡分离株SD09DP04的U3区嵌合病毒的感染性克隆，拯救出2株病毒，并对拯救出的嵌合病毒的生物学特性进行了分析。

1 材料与方法

1.1 病毒株、细胞、载体和菌种

ALV-J病毒株SD09DP04由本实验室分离保存［12］；ALV-J原型毒株HPRS-103基因组全长已经克隆到p UC19载体上，该质粒命名为p UC19-HPRS-103，由英国Pirbright研究所病毒性肿瘤病实验室惠赠；DF-1细胞由笔者所在实验室保存，用于病毒的拯救和增殖；pBlueScript II KS（＋）载体和DH5α菌种由笔者所在课题组保存。

1.2 主要试剂

各种限制性内切酶、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、DNA Marker、d NTP、T4DNA连接酶、PUC19空载体等购自大连宝生物工程有限公司；FITC标记的抗鼠IgG荧光抗体、pGL3 Luciferase Reporter Vectors检测试剂盒购自Sigma公司；脂质体（LipfectamineTM2000）购于GiBcoBRL公司；质粒提取试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；Plasmid Mini Kits为QIAGEN公司产品；反转录酶活性检测试剂盒为Roche公司产品；ALV-J的p27蛋白单克隆抗体为本实验室保存［13］。

1.3 引物设计

根据ALV-J原型株HPRS-103在GenBank中的序列设计3对特异引物，用以扩增病毒的前病毒基因组。同时，根据构建3′-U3区嵌合病毒的需要设计融合PCR所需引物。引物序列见表1。

1.4 融合PCR

用DNA凝胶回收试剂盒回收以质粒HPRS-103为模板，R1-F、R1-R这对引物扩增的特异片段R1（2 333 bp），R2-F、R2-R这对引物扩增的特异片段R2（99 bp）。胶回收以质粒SD09DP04为模板，R3-F、R3-R这对引物扩增的特异片段R3（226 bp）。将R1、R2、R3做融合PCR，得到2 658 bp的片段，命名为A-DPU3备用。

1.5 嵌合病毒HPRS-103ΔDPU3株感染性克隆构建

以KpnⅠ和SacⅠ双酶切凝胶回收的融合PCR产物A-DPU3及空载体p UC19，经连接和转化后，挑取单克隆白色菌落进行鉴定，阳性重组质粒命名为p UC19-A-DPU3；以BF、BR为引物，质粒p UC19-HPRS-103为模板PCR扩增B片段。以Hin dⅢ和HpaⅠ双酶切凝胶回收的PCR产物和p UC19-A-DPU3，经连接转化后，挑取单克隆白色菌落进行鉴定，阳性重组质粒命名为p UC19-ADPU3-B。以CF、CR为引物，质粒p UC19-HPRS- 103为模板PCR扩增C片段，以HpaⅠ和KpnⅠ双酶切凝胶回收PCR产物及p UC19-A-DPU3-B，经连接和转化后，挑取单克隆白色菌落进行鉴定，阳性重组质粒命名为p UC19-A-DPU3-B-C，即嵌合病毒HPRS-103ΔDPU3株感染性克隆。构建策略如图1。

表1 扩增PBW-ALV-J前病毒基因组的引物Table 1 Primers used for amplification of PBW-ALV-J pri-DNA

图1 嵌合病毒重组质粒PUC19-A-DPU3-B-C构建策略Fig.1 The diagram of the construction strategy about the recombinant plasmid PUC19-A-DPU3-B-C

1.6 细胞转染及病毒拯救

用QIAGEN公司的产品Plasmid Mini Kit分别纯化p UC19-HPRS-103和p UC19-A-DPU3-B-C，由LipfectamineTM2000分别介导转染约80%的单层DF-1细胞，同时以正常的DF-1为对照，转染后6 h弃细胞上清，用只加双抗的DMEM清洗两遍，每孔加入2 m L含10%胎牛血清的加入双抗的DMEM，在37℃温箱中继续培养，转染72 h后收毒，冻存于-80℃冰箱。反复冻融三次后连续在DF-1上传代，经鉴定后将拯救的病毒命名为r H-PRS-103和r HPRS-103ΔDPU3。

1.7 病毒粒子的鉴定

1.7.1 间接免疫荧光试验 将拯救的2株病毒按照常规方法接种于约70%单层DF-1的48孔板中，7 d后按常规方法进行间接免疫荧光检测，检测所用一抗为抗ALV-J p27蛋白的单克隆抗体，二抗为FITC标记的兔抗鼠IgG抗体，同时设不接毒的DF-1细胞作为对照。

1.7.2 群特异性禽白血病病毒抗原检测 使用禽白血病病毒抗原检测试剂盒［13］，参照其试剂盒说明书的具体步骤，对拯救的两株病毒进行检测。

1.7.3 反转录酶检验 用reverse transcriptase assay检测病毒的反转录酶的活性，首先用PEG法处理接毒的细胞液，按照试剂盒说明要求，对拯救的两株病毒进行反转录酶活性的检测。

1.8 r HPRS-103和r HPRS-103ΔDPU3的U3区启动子活性、增强子活性差异检测

将ALV-J实验室分离株SD09DP04和原型株HPRS-103的U3区分别克隆至p GL-Enhancer Vector或p GL-Promoter Vector（引物序列如下，DPU3F：AGCGGTACCAATGTAGTCTTATGCAATACTCT；DPU3R：AGCAAGCTTGTTTATTGTATCAAGCTAGG；103U3F：GCGGTACCAATGTAGTGTTATGCAATACTCT；103U3R：CGAAAGCTTGTTTATTGTGTCGGGCTA）。转化DH5α大肠杆菌感受态。挑取单克隆，用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒后测序鉴定正确，将质粒命名为E-DPU3、E-103U3和P-DPU3、P-103U3，分别用于检测比较U3区的启动子活性和增强子活性。用QIAGEN的Plasmid Mini Kits纯化构建好的4种质粒，用LipfectamineTM2000分别介导转染约80%的单层DF-1细胞的6孔板中，同时转染p GL-Enhancer Vector或p GL-Promoter Vector作为阴性对照。转染后48 h按照p GL Luciferase Reporter Vectors试剂盒检测说明书进行荧光检测，统计并分析数据。

1.9 r HPRS-103和r HPRS-103ΔDPU3复制动力学的比较

将两株拯救的病毒以1×102TCID50的病毒量接种铺有单层的DF-1细胞的6孔板中（约1×106个细胞），感染后1、2、3、4、5、6、7 d分别取细胞上清，用禽白血病病毒抗原检测试剂盒检测p27，用于其复制动力学比较，重复测定3次，取其平均值，绘制病毒的复制动力学曲线。

2 结 果

2.1 ALV-J嵌合病毒重组质粒的鉴定

用KpnⅠ、SacⅠ单酶切；Hin dⅢ和HpaⅠ双酶切，鉴定重组质粒p UC19-A-DPU3-B-C。酶切结果显示，重组质粒p UC19-A-DPU3-B-C经KpnⅠ、SacⅠ单酶切后，均为大小为10 695 bp的单一清晰条带，而经Hin dⅢ和HpaⅠ双酶切后，则得到大小分别为2 957和7 738 bp的2条条带（图2）。同时将构建好的重组质粒全长测序，测序结果显示构建成功。

图2 感染性克隆p UC19-A-DPU3-B-C的酶切鉴定Fig.2 Enzyme identification of the infectious clone pUC19-A-DPU3-B-C

2.2 病毒粒子的鉴定

2.2.1 间接免疫荧光鉴定 r HPRS-103、r HPRS-103ΔDPU3的第5代病毒与抗ALV-J的p27蛋白的单克隆抗体均呈阳性反应。感染组DF-1细胞表面以及细胞质有明显的绿色荧光（图3）。对照组DF-1细胞内没有绿色荧光。该结果表明，2株病毒均得到成功拯救。

2.2.2 群特异性抗原检测 用禽白血病病毒抗原检测试剂盒检测这2株拯救病毒的第5代病毒，绘制标准曲线。阳性对照孔在OD650nm吸光度平均值为0.368，阴性对照孔在OD650nm吸光度平均值为0.078。由公式得临界值＝0.2×（阳性对照平均值—阴性对照平均值），计算得临界值为0.136。r HPRS-103株在OD650nm吸光度检测的平均值为0.795，r HPRS-103ΔDPU3株在OD650nm吸光度检测的平均值为0.967。抗原检测结果表明，2株病毒均得到成功拯救。

图3 r HPRS-103、r HPRS-103ΔDPU3株的间接免疫荧光鉴定结果Fig.3 Identification of r HPRS-103，r HPRS-103ΔDPU3 by IFA

2.2.3 反转录酶检验 采用Roche的反转录酶检测试剂盒，利用HIV反转录酶标准品绘制标准曲线，再通过吸光度确定第5代拯救病毒的反转录酶活性，通过ELISA检测，取3次检测结果的平均数。2株病毒ELISA在OD450nm处吸光值分别如下：r HPRS-103为3.128，r HPRS-103ΔDPU3为2.985。所对应的反转录酶活性分别为1.528 1和1.324。结果表明，2株病毒均得到成功拯救。

2.3 rHPRS-103、rHPRS-103ΔDPU3复制动力学的比较

绘制的病毒复制动力学曲线见图4。结果表明，r HPRS-103、r HPRS-103ΔDPU3两株病毒体外复制无明显差异。

图4 拯救病毒的复制动力学曲线Fig.4 Proliferation kinetics curve of the rescued viruses

2.4 U3区启动子及增强子活性差异比较

按p GL3 Luciferase Reporter Vectors试剂盒检测说明书对转染后48 h的细胞进行荧光检测。结果如图5。检测结果表明，r HPRS-103、r HPRS-103ΔDPU3的U3区启动子活性和增强子活性均无明显差异。

图5 ALV-J实验室分离株SD09DP04与原型株HPRS-103 U3区启动子活性（A）、增强子活性（B）结果Fig.5 The results of the promoter（A）／enhancer（B）activity between laboratories isolated virus SD09DP04 and classical virus HPRS-103

3 讨 论

自2008年以来，ALV-J的感染在中国出现大范围的流行［7，12］。而与此同时，ALV-J的流行毒株的基因组序列与原型毒株HPRS-103相比也出现了一些特异有规律的变化。通过笔者实验室所进行的流行病学调查以及对ALV-J流行毒株U3区的基因序列分析，发现87.5%（14／16）的流行毒株具有14个碱基的规律性突变。而且，流行毒株的U3区与原型毒株及多株肉鸡分离株的U3区的进化树分析显示，此流行毒株的U3区处于一个新的分支上［12］。由于U3区在病毒的复制增殖过程中有着重要的调控作用，含有多种与病毒复制密切相关的启动子和增强子元件［14］。且最近的一些研究表明，ALV-J倾向于出现有利于其迅速进化的突变［10］。而上述流行毒株中出现的U3区的规律性突变正是ALV-J在其进化过程中自然发生的，这就表明其很有可能是ALV-J本身适应自然界，增强其增殖能力的一个有利进化。因此，对此具有特异性规律突变的U3区的功能及其对病毒复制的影响的研究，成为本研究的主题。本研究所拯救的ALV-J嵌合病毒中的U3区，即为近年来流行毒株SD09DP04的U3区序列，并且具有上述U3区的特异性规律特征。

本研究构建了1株3′-U3区嵌合禽白血病病毒感染性克隆（p UC19-A-DPU3-B-C），与p UCHPRS-103分别转染DF-1细胞获得2株拯救病毒。ALV属于反转录病毒，前病毒全基因组克隆被转染于DF-1后，即可利用宿主细胞的RNA聚合酶II，启动转录、翻译过程，并最终完成病毒的包装和释放，所以在设计ALV感染性克隆时，不需要考虑启动子和核酶序列等修饰因子［15］。

构建感染性克隆并拯救相应病毒，对于研究病毒基因组某一部分的作用，例如其对于整个病毒复制过程的影响，具有十分重要的意义。为了排除质粒瞬时转染蛋白质的可能性，本研究将转染后的病毒经过连续传代后，再进行一系列病毒活性的检测，并且同时采用多种检测方法，最终确定成功拯救出病毒，为后续的试验研究奠定了基础。

在本研究之中，对拯救的原型毒株r HPRS-103和嵌合病毒r HPRS-103ΔDPU3的复制动力学曲线的测定结果表明这两株拯救病毒的体外复制能力无明显差异。为进一步探索U3区碱基的突变对于病毒的复制能力无影响的机制，鉴于U3区含有多种顺式作用元件，起重要的增强子和启动子活性功能，我们对流行毒株的U3区与原型毒株U3区的启动子活性及增强子活性进行检测。检测结果表明，流行毒株的U3区其启动子活性和增强子活性均与原型毒株的U3区无明显差异。这些数据都表明，流行毒株的U3区的规律性突变，没有增强其U3区的增强子或启动子活性，进而对ALV-J的复制能力未造成影响。

但是，ALV-J是反转录病毒，其在宿主体内复制过程中，首先要整合至宿主基因组内，而后再进行一系列复制过程。U3区是决定ALV-J整合入宿主基因组的整合位点的重要区域。而且，在2008年以前，ALV-J主要感染肉鸡群并引起骨髓瘤，但是在2008年后ALV-J的广泛流行过程中，出现了ALVJ感染蛋鸡的病例，同时还引起感染鸡发生血管瘤。由于U3区在ALV-J整合入宿主基因组过程中所起的重要作用，我们猜想流行毒株U3区的规律性突变可能与宿主的改变或者引起肿瘤类型的改变有关，但这还有待于进一步研究。

4 结 论

利用融合PCR技术，以ALV-J HPRS-103株为骨架构建含SD09DP04株3′-U3区的嵌合病毒的cDNA克隆。嵌合病毒与HPRS-103的感染性克隆转染DF-1细胞，成功拯救到2株病毒，3′-U3区启动子活性和增强子活性的检测以及复制动力学分析结果显示，出现特异性规律性突变的U3区对于原毒株的体外复制能力无显著影响。

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