加味玉屏风散及单味中药对假丝酵母菌的体外抑菌作用



加味玉屏风散及单味中药对假丝酵母菌的体外抑菌作用

吴亚1，范世英2，魏宏莲2，曹爽1

(1.河北省中医院检验科；2.河北医科大学附属第二医院检验科，河北 石家庄050011)

摘要:目的观察加味玉屏风散及单味中药对假丝酵母菌的体外抑菌效果，旨在寻求中药在抗真菌方面的优势作用。方法用琼脂稀释法观察加味玉屏风散各组和单味中药黄连、茵陈、炙黄芪对104株假丝酵母菌的体外抑菌作用。结果玉屏风散+黄连、玉屏风散+黄连+茵陈、黄连的抑菌效果较好，50%最低抑菌浓度(MIC50)分别为6.25、25.00、1.56 g·L-1，且对热带假丝酵母菌的抑菌效果最好，其次为光滑假丝酵母菌、白假丝酵母菌和葡萄牙假丝酵母菌，对近平滑假丝酵母菌抑菌效果较差。玉屏风散和炙黄芪仅对热带假丝酵母菌有一定抑菌效果，未发现茵陈对假丝酵母菌有抑菌作用。结论黄连及含黄连的加味玉屏风散对各种假丝酵母菌均有抑制作用，尤其是对耐药率较高的非白假丝酵母菌有较强的抑菌功效。这点对临床研究更有价值。

关键词:加味玉屏风散；黄连；茵陈；炙黄芪；假丝酵母菌；琼脂稀释法

随着广谱抗生素、免疫抑制剂以及侵入性诊断治疗的应用，真菌感染的发病率日益增加。但目前临床上应用的西药抗真菌药物，存在毒性大、耐药性增加、费用高等缺点。为了寻找中药在抗真菌方面的优势作用，笔者对加味玉屏风散及几种单味中药用琼脂稀释法进行了体外抑菌试验，寻求中药对真菌的抑菌功效。

1材料

1.1菌株2013年3月至2014年3月河北省中医院微生物室分离的假丝酵母菌104株，其中白假丝酵母菌48株，热带假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌各20株，近平滑假丝酵母菌12株，葡萄牙假丝酵母菌4株，菌株分别来自患者的血液、中段尿和痰液标本。质控菌株为白假丝酵母菌90028。

1.2培养基(1)RoswellParkMemorialInstitute1640(RPMI1640)液体培养基：将RPMI1640粉末20.8g，葡萄糖40g，用0.33mol·L-1三吗琳基丙磺酸(MOPS)缓冲液溶解，同时用1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)调整pH值至6.9~7.1，最后定容至1L，过滤除菌备用。(2)4%琼脂:将40g琼脂溶于1 000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，备用。

1.3药液储存液制备 (1)中药制剂分组：A组：玉屏风散(防风 ∶炙黄芪∶炒白术=1∶2 ∶2)；B组：玉屏风散+黄连；C组：玉屏风散+茵陈；D组：玉屏风散+黄连+茵陈；E组：炙黄芪；F组：黄连；G组：茵陈。(2)将中药按常法做成煎液，即每组取中药总量100g，加适量蒸馏水浸泡30min,强火加热煮沸，再以文火煎煮30min，纱布过滤，滤渣再加适量蒸馏水煎煮30min，过滤弃渣，合并滤液，加热浓缩到0.1L，即相当于原生药1 000g·L-1。121℃高压灭菌20min，-20℃冰箱保存备用。

1.4主要仪器和试剂(1)高压蒸汽消毒锅：日本三洋株式会社产品；(2)电热恒温培养箱：南京智拓仪器仪表有限公司产品；(3)比浊仪：法国梅里埃生物制品公司产品；(4)MIT-P多点接种仪：日本佐久间制作所产品；(5)沙保罗平板、琼脂粉、葡萄糖均购自杭州天和微生物试剂有限公司；(6)RPMI1640粉：美国LifeTechnologiesInc产品；(7)MOPS粉：Fluka公司产品；(8)黄连、茵陈、黄芪(蜜炙)、防风、白术(炒)：均购于河北省药材公司。

2方法

采用琼脂稀释法，对A~G组进行定量抑菌试验。

2.1药物平板制备将RPMI1640液体培养基与4%琼脂于60℃ 1 ∶1混匀，分装入试管中，每管分装18mL,仍置60℃保温。将倍比稀释后的不同浓度的中药液2mL加于试管中，轻轻振摇混匀，倒入直径90mm平皿，置水平桌面使之凝固，最终配制成含中药浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39g·L-1的药物平板，并设不含中药的琼脂平板为生长对照，不接种菌液且不含中药的琼脂平板做空白对照。

2.2菌悬液制备将104株受试菌和质控菌株(白假丝酵母菌90028)在沙保罗平板连续传代培养2次，以确保菌落的纯化和活力，第2次35℃传代培养48h后取培养菌落用无菌生理盐水分别配制成0.5麦氏比浊的菌悬液。

2.3培养与观察用MIT-P多点接种仪将配制好的0.5麦氏比浊菌悬液10μL接种于含不同中药浓度的药物平板和生长对照平板上，于35℃培养48h，如果生长对照平板假丝酵母菌全部生长且空白对照平板无假丝酵母菌和杂菌生长，则观察含中药各药物平板的最低抑菌浓度(MIC)，并统计出50%最低抑菌浓度(MIC50) 和90%最低抑菌浓度(MIC90)的药物浓度和累积抑菌百分率；同时观察对各中药制剂组对各种假丝酵母菌的最低抑菌浓度范围(MIC范围)。

3结果

3.1各中药制剂组对假丝酵母菌的抑菌作用通过对104株假丝酵母菌进行体外抑菌试验，结果表明黄连(F组)的抑菌效果最好，MIC50和MIC90分别为1.56g·L-1和6.25g·L-1，其次是玉屏风散+黄连(B组)和玉屏风散+黄连+茵陈(D组)，其MIC50分别为6.25g·L-1和25.00g·L-1，茵陈(G组)的抑菌效果最差。结果见表1。

表1　各中药制剂组对104株假丝酵母菌

3.2各中药制剂组对104株假丝酵母菌的累积抑菌百分率见表2。

表2　各中药制剂组对104株假丝酵母菌的累积抑菌率比较/%

3.3各中药制剂组对各种假丝酵母菌的抑菌作用玉屏风散+黄连(B组)和玉屏风散+黄连+茵陈(D组)和黄连(F组)对热带假丝酵母菌的抑菌效果最好，其次为光滑假丝酵母菌和白假丝酵母菌，对近平滑假丝酵母菌抑菌效果最差；玉屏风散(A组)和炙黄芪(E组)仅对热带假丝酵母菌有一定抑菌作用。茵陈(G组)未检出抑菌作用结果见表3。

表3　各中药制剂组对各种假丝酵母菌的MIC范围/g·L-1

4讨论

近年来随着抗生素、激素、免疫抑制剂等药物以及介入治疗的广泛应用，临床上真菌感染的比例大大增加，对抗真菌药物的耐药问题也越来越突出，因此，开发研究既可有效对抗真菌感染，毒副作用又较小，适合免疫力低下人群使用的抗真菌药物显得越来越重要。本试验采用琼脂稀释法，进行了复方中药和单味中药对104株假丝酵母菌的体外抑菌试验，试验发现，玉屏风散+黄连、玉屏风散+黄连+茵陈、黄连对假丝酵母菌具有较强的体外抑菌作用，其 MIC50分别为6.25、25.00和1.56 g·L-1，且对热带假丝酵母菌抑菌作用最强，对白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌次之，对葡萄牙假丝酵母菌也有一定的抑制作用，对近平滑假丝酵母菌较差。与胡吉生等[1]报导黄连对念珠菌体外试验具有较强的抑菌作用,且黄连的抑菌效果最好相符。近年来非白假丝酵母菌(包括热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌等)引起的感染越来越受重视，这些非白假丝酵母菌对常用抗真菌药物氟康唑都表现出较高的耐药性[2]，本试验中无论是单味中药黄连还是含黄连的复方中药组都观察到了对非白假丝酵母菌有较强的抑菌作用。黄连的临床功效很强大，除了对产超广谱β内酰胺酶和不产酶的大肠埃希菌有抑菌作用[3]外，黄连的主要成分小檗碱对白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌的生长均具抑制作用[4]。和刘涛峰等[5]报道黄连对白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌等的标准菌株均有较强的抑菌作用一致。这一抑菌作用为临床上对抗非白假丝酵母菌感染指出了一条可行之路。

假丝酵母菌属引起的感染属于机会性感染，常见于免疫力低下人群[2]。玉屏风散，被称为中药免疫调节剂，主治表虚自汗，易感风邪。玉屏风散能够使单纯肾病综合征患儿免疫功能增强,继发性复发与感染的概率得到明显降低[6-7]。玉屏风散中的黄芪的重要化学成分黄芪多糖具有多种功效,包括增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等广泛功效[8]。白术能够提高细胞免疫功能和体液免疫功能。防风有祛风、镇痛、发汗、解热、抗菌之作用。在假丝酵母菌感染治疗时，玉屏风散+黄连和玉屏风散+黄连+茵陈不仅能提高机体免疫力，也能发挥抑制真菌作用。试验中未发现茵陈的抗真菌作用，这与章林平等[9]报道茵陈挥发油中的茵陈炔酮有抑制真菌作用结果不一致，这可能与中药的提取方式有关。有些具有抑制真菌作用的成分可能不溶于水，或者煎煮时不耐受高温而被破坏或挥发，影响了抑菌效果，这些有待于进一步研究和改进工艺。

总之，无论是黄连还是含黄连的加味玉屏风散制剂对假丝酵母菌都有较强的抑制作用，有研究表明[10]氟康唑与盐酸小檗碱对耐药真菌的协同作用,是通过增加真菌胞内的盐酸小檗碱含量。可见，中西医结合治疗真菌感染也是一条可行之路。

参考文献:

[1]胡吉升,胡志敏,童中胜,等.17味单味中药煎剂对阴道致病念珠菌的体外抑菌试验研究 [J].湖北中医杂志,2013,35(6):23-24.

[2]李慧平,常婧.临床常见假丝酵母菌属的分布及耐药分析[J].中华医院感染杂志,2012,22(22):5157-5159.

[3]许韦,邵志伟,李小东,等.黄岑等10种中药对大肠埃希菌的体外抑菌试验观察[J]. 安徽医药,2013,17(5):846-848.

[4]周笑梅,宁玉梅.单味中药抑制白假丝酵母菌作用的研究进展[J].中华中医药学刊,2011, 29(3):580-581.

[5]刘涛峰,郑玉荣,刘小平,等.10种中药水煎剂对念珠菌的体外抑菌作用[J].安徽中医学院学报,2012,21(4):72-74.

[6]朱香兰.玉屏风散治疗单纯性肾病综合征儿童继发性免疫功能低下临床研究[J].辽宁中医杂志,2014,41(4):749-750.

[7]韦蓉,阮毅燕,邱玉芬,等.玉屏风颗粒对原发性肾病综合征儿童体液免疫功能影响的研究[J]. 现代中西医结合杂志, 2013,22(11):1211-1212.

[8]柏冬志,东方,唐文婷,等.黄芪多糖药理作用的研究进展[J]. 黑龙江医药，2014,27(1):103-106.

[9]章林平,孙倩,王威,等.茵陈有效成分的药理作用及其临床应用的研究进展[J]. 抗感染药学,2014,11(1):28-31.

[10] 王晓飞.氟康唑和小檗碱的真菌胞内含量及协同抗耐药机制研究[D]. 福州:福建中医药大学,2013.

常用医学名词术语的规范表达

Inhibition test of the flavored yupingfeng powder and single traditional

Chinese medicine against candida in vitro

WU Ya1,FAN Shi-ying2, WEI Hong-lian2, et al

(1.HebeiTraditionalChineseMedicalHospital;2.TheSecondHospitalAffiliated

toHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Abstract:ObjectiveThroughobservingthein vitroinhibitioneffectsofflavoredyupinfengpowderandsingletraditionalChinesemedicineagainstcandida,toseektheantifungaleffectsoftraditionalChinesemedicine(TCM) .MethodsUsingAGARdilutionmethodtoobservein vitroinhibitioneffectoftheflavoredyupingfengpowderandsingletraditionalChinesemedicine(e.g.,rhizomacoptidis,herbaartemisiae,RadixAstragalipreparata)to104strainsofcandida.ResultsFungiinhibitioneffectsofYupingfengpowder+rhizomacoptidis,yupingfengpowder+rhizomacoptidis+herbaartemisiae,andrhizomacoptidisaregood.Theminimalinhibitoryconcentrationsof50% (MIC50)were6.25, 25.00and1.56g·L-1,respectively.Tropicalcandidashowedbestinhibitoryresponse,followedbysmooth-candida,whitecandidaandportugalcandida,whilenearlysmoothcandidatheworst.YupingfengpowderandRadixAstragalipreparatahascertainantifungaleffectsonlyfortropicalcandida.Herbaartemisiaedidn’tshowanyantifungaleffects.ConclusionsRhizomacoptidisandtheflavoredyupingfengpowderwithcoptishasstronginhibitionefficacyforavarietyofcandida,especiallyforthenon-Candidaalbicanswithhigherpercentages.Itismorevaluableforclinicalresearch.

Keywords:theflavoredyupinfengpowder;rhizomacoptidis;herbaartemisiae;radixastragalipreparata;candida;AGARdilutionmethod

(收稿日期：2014-06-26，修回日期：2014-07-28)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.055

基金项目：河北省中医药管理局2013年科研计划项目(No 2013048)