水通道蛋白1在小鼠脂肪栓塞综合征肺损伤中的作用

田　鲲，刘　溪，章怡苇，王爱忠

(上海交通大学附属第六人民医院麻醉科，上海 200233)

水通道蛋白1在小鼠脂肪栓塞综合征肺损伤中的作用

田鲲△，刘溪，章怡苇△，王爱忠※

(上海交通大学附属第六人民医院麻醉科，上海 200233)

摘要：目的 建立脂肪栓塞综合征(FES)肺损伤模型，探讨水通道蛋白1(AQP1)在FES肺损伤发生、发展过程中的作用。方法 ①96只健康成年雄性C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分为对照组、FES 4 h组、6 h组、12 h组、24 h组和48 h组，每组16只。FES各组小鼠尾静脉注射同种异体小鼠肾周脂肪，对照组给予相同剂量无菌生理盐水。在相应的时间点取小鼠肺组织进行苏木素伊红染色，测量肺湿/干比值(W/D)变化，采用蛋白质免疫印迹法及免疫组织化学法测定AQP1的表达。②24只 C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分为对照组、FES 24 h组和AQP1抑制剂组，每组8只,观察抑制AQP1对FES肺损伤病理过程的影响。结果①FES 4 h组、6 h组、12 h组、24 h组、48 h组W/D值分别为5.19±0.34、5.53±0.24、5.81±0.54、5.77±0.47、5.35±0.15，均高于对照组的4.30±0.47，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组和FES组4、6、12、24、48 h的AQP1蛋白表达分别为0.85±0.25、1.00±0.30、0.98+0.39、0.66±0.20、2.02±0.65、1.26±0.35，差异有统计学意义(P<0.05)，其中FES 24 h组显著高于对照组(P<0.05)。②FES 24 h组、抑制剂组、对照组肺组织W/D值分别为5.70±0.35、4.71±0.13、4.31±0.37，差异有统计学意义(P<0.05)，其中抑制剂组显著低于FES 24 h组(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.05)。结论AQP1可能在FES肺损伤的发生过程中起重要作用，抑制AQP1有助于缓解FES肺损伤导致的水肿。

关键词：脂肪栓塞；肺损伤；水通道蛋白质1

脂肪栓塞综合征(fat embolism syndrome，FES)是指脂肪颗粒阻塞血管腔而引起的一系列病理生理改变的临床综合征，其主要症状为呼吸困难、低氧血症，无头部外伤的神经症状以及皮肤黏膜出血点，其发生率主要与骨折创伤的严重程度和长骨骨折数量呈正相关[1]。由于循环的生理特点，肺微血管是脂肪栓子首先到达的部位，栓子栓塞肺部毛细血管以及小血管导致肺组织缺氧，毛细血管通透性升高，并释放非酯化脂肪酸对肺泡细胞产生毒害作用引起肺水肿，患者可于早期就出现呼吸困难[2]。水通道蛋白对水的转运发挥重要作用，水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)是分布于肺中的主要水通道蛋白质之一，在肺泡和毛细血管之间的液体交换中扮演着重要角色，有关AQP1在脂肪栓塞肺损伤中的研究少有报道。本研究旨在建立FES肺损伤模型，探究AQP1在FES肺损伤中的变化以及作用。

1材料与方法

1.1实验动物SPF健康成年雄性C57BL/6J小鼠120只，体质量22～24 g，由上海西普尔必凯实验动物公司供应，动物生产许可证SCXK(沪)2008-0016，上海交通大学附属第六人民医院动物中心饲养，动物使用许可证SYXK(沪)2011-0128，小鼠笼盒饲养，自由进食、饮水。

1.2FES肺损伤模型的建立及分组注射用脂肪的制备及保存参照尚嘉伟等[3]的方法。96只小鼠按随机数字表法分为对照组、FES 4 h组、6 h组、12 h组、24 h组、48 h组，每组16只。FES组均于尾静脉注射2 μL/g脂肪，分别在注射脂肪4、6、12、24、48 h后取肺组织样本。对照组尾静脉给予相同体积的无菌生理盐水。

1.3FES模型的验证

1.3.1肺组织病理形态学检查给予戊巴比妥麻醉小鼠后，乙醇消毒小鼠皮肤，从右心室注射无菌等渗盐水和4%多聚甲醛灌洗肺循环及肺泡腔，取下肺组织经固定、脱水、石蜡包埋、切片后苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。

1.3.2肺湿/干重比值(W/D)的测定取对照组和FES 4、6、12、24、48 h组肺组织样本，称量此时肺组织重量，记为湿重，将6组肺组织样本放置于烘箱中70 ℃ 48 h后取出记录干重，计算各组W/D值。

1.4AQP1的表达

1.4.1Western blot分析剖胸取肺组织，在冰上裂解组织后聚氰基丙烯酸正丁酯试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min后，蛋白转至聚偏二氟乙烯膜(恒流200 mA，60 min)，5%脱脂牛奶室温封闭90 min，AQP1一抗(1∶800，美国Chemicon公司，批号：121951-8)4 ℃ 摇床过夜，辣根过氧化物酶标记二抗(1∶2000，美国Abcam 公司，批号：34237-11)室温摇床孵育2 h，化学发光试剂盒显影(美国Thermo科学公司，批号：20130930)，图像扫描成像，以β-αctin为内参进行半定量分析。

1.4.2免疫组织化学法取肺组织，石蜡包埋切片后，脱蜡脱水，磷酸盐缓冲液冲洗，柠檬酸钠(pH=6)微波抗原修复，按照免疫组织化学试剂盒(Thermo公司，批号：20140219)说明，超级封闭液封闭，AQP1一抗(1∶1000，美国Chemicon公司，批号：168980-2)室温15 min，生物素化抗体孵育，抗体效能放大试剂，二氨基联苯胺试剂显色，苏木精复染，盐酸酒精分色，无水乙醇脱水二甲苯透明后封片。

1.5抑制AQP1对FES肺损伤病理过程的影响24只C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为对照组、FES 24 h组、AQP1抑制剂组，每组8只。AQP1抑制剂布美他尼[4](美国Sigma公司， 28395-03-1)溶解在中NaOH溶液中，调整pH为7.5配成2.25 g/L，按0.1 mg/g腹腔注射。给予AQP1抑制剂10 min后尾静脉注射2 μL/g脂肪，24 h后取肺组织，进行HE染色及肺组织W/D测定。

2结果

2.1脂肪栓塞小鼠的症状及体征健康的C57BL/6J小鼠注射同种异体脂肪后出现行动迟缓，反应迟钝，不喜活动，呼吸急促，脂肪尿甚至出现偏瘫症状，5只小鼠在注射数分钟内死亡。

2.2肺组织肉眼观以及小鼠肺病理形态正常的小鼠肺呈粉红色，表面光滑无出血点以及水肿；FES小鼠的肺表面可见散在暗红色梗死灶，肺水肿而变大，HE染色正常肺组织形态结构完整而FES肺组织结构紊乱，肺泡间隙增宽，炎性细胞浸润，肺泡壁增厚断裂，肺泡腔内可见红细胞，见封三图1。

2.3肺组织W/D值测定对照组和FES组4、6、12、24、48 h的W/D值分别为4.30±0.47、5.19±0.34、5.53±0.24、5.81±0.54、5.77±0.47、5.35±0.15，差异有统计学意义(F=61.86，P<0.05)，其中FES组4、6、12、24、48 h的W/D值均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4Western blot 检测AQP1蛋白的表达对照组和FES组4、6、12、24、48 h的AQP1蛋白表达分别为0.85±0.25、1.00±0.30、0.98+0.39、0.66±0.20、2.02±0.65、1.26±0.35，差异有统计学意义(F=2.67，P<0.05)，其中FES 24 h 组AQP1蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)，其他各组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见封三图2。

2.5免疫组织化学结果AQP1主要表达于血管内皮细胞，与对照组相比FES 24 h和48 h组表达增强较显著，见封三图3。

图2　水通道蛋白1(AQP1)的表达情况

2.6抑制AQP1对FES肺损伤病理过程的影响

2.6.1肺组织病理形态学检查对照组肺组织结构完整，无炎性细胞浸入；FES 24 h组肺组织间隙增大，肺泡隔增厚断裂，肺泡腔内可见红细胞；AQP1抑制剂组肺组织形态较脂肪组好转。见封三图4。

2.6.2肺组织W/D值得测定FES 24 h组、抑制剂组、对照组肺组织W/D值分别为5.70±0.35、4.71±0.13、4.31±0.37，差异有统计学意义(F=56.26，P<0.05)，其中抑制剂组显著低于FES 24 h组(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.05)。

3讨论

FES是指脂肪小滴进入循环并导致一系列症状和体征的临床综合征，常发生于长骨骨折或盆腔骨折后，下肢关节置换术后FES的发生率也较高，也可继发于机体及其他脂肪组织的创伤，如抽脂，甚至与创伤无关，接近90%的长骨骨折和重大创伤患者均有脂肪栓塞，仅2%～5%的患者发展为FES[1,5]。典型的FES患者通常在伤后12～48 h内出现呼吸系统和脑部症状以及皮肤黏膜瘀斑三联征，呼吸功能障碍常早期出现，症状轻重不等，轻者有呼吸急促、呼吸困难，重者类似急性呼吸窘迫综合征。由于脂肪颗粒聚集于肺毛细血管以及小血管导致肺动脉高压，同时在脂蛋白酯酶的作用脂肪酸分解下释放出高浓度的非酯化脂肪酸，引起血小板聚集，轻微的弥漫性血管内凝血及肺毛细血管破裂，肺组织学检查示肺泡内出血，肺泡上皮细胞受损导致肺水肿[6]。本研究中，FES组W/D干湿比从4 h开始增加，说明此时肺水肿已经出现，一直持续到48 h以后，48 h虽然相比24 h有所降低，但仍高于正常对照组，说明48 h后肺水肿有所好转但却并未完全消退。与此同时，肺组织形态学的变化过程与W/D的趋势基本一致，注射脂肪4 h后肺泡隔已出现断裂，肺组织结构紊乱，12、24 h肺泡间隔明显增厚、断裂，肺泡腔内可见红细胞，48 h后肺组织结构完整性逐渐恢复，上述过程表明肺水肿是FES发生过程中的重要环节。本实验肺组织病理形态的结果与Inoue等[7]在大鼠模型中所得到的结论不一致，可能与本研究造模所用动物、脂肪种类以及剂量不同有关，本研究采用的是同种异体的小鼠肾周的脂肪，更接近于临床上FES的发生。

AQP1是水通道蛋白的一个亚型，它是第1个被发现的水通道蛋白，在红细胞上首次被发现。AQP1一般以同源四聚体的形式存在于细胞膜脂质双分子层，组成同源四聚体的每个单体均有一个独立的水孔结构，水分子可以顺着渗透梯度高速的自由通过，其转运水分子具有双向性[8]。AQP1与AQP5是肺中最主要的两种水通道蛋白，AQP1位于肺微血管内皮细胞上，AQP5主要表达在Ⅰ型肺泡上皮，这两者对血管和肺泡之间的液体转运起最主要的作用[9-10]。本研究免疫组织化学结果显示，AQP1在肺的微血管内皮细胞上有明显表达，这与以往的文献报道相似[11]，并且24 h与48 h的表达比正常对照组增强，与Western blot的结果比较一致，但与W/D的结果趋势不同。注射脂肪4 h后W/D开始增加，但AQP1的表达变化不大，出现这种现象的原因可能是缺氧及早期非酯化脂肪酸等因素对细胞的毒害作用，导致细胞死亡和AQP1减少，为了代偿与此同时胞质的AQP1向胞膜转运致使AQP1的变化不明显。随着12 h后AQP1的表达逐渐增加直至24 h，肺水肿持续严重，24 h后AQP1表达下调，与此同时肺水肿的情况也有所好转。文献报道，AQP1敲除小鼠的离体肺中，肺泡与血管内皮细胞之间依赖渗透梯度的水通透性减少了90%，敲除AQP1可以减弱由于灌注流体静水压急剧增加导致的肺部水的集聚[9,12]。推测其原因可能是血管内皮AQP1减少导致由血管进入肺泡间隙的水分减少，从而减轻水肿。为了验证这一猜想，本研究选取了AQP1表达最显著的时间点24 h，进行抑制剂实验，W/D和肺组织病理形态的结果显示，在24 h给予AQP1抑制剂后，肺水肿的情况得到好转，并且肺组织的形态也得到一定程度的恢复，表明12 h后AQP1的增加可以促进肺水肿，48 h后随着AQP1的下调，肺水肿情况减轻，说明AQP1有可能参与FES肺损伤的恢复过程。这与King等[13]的报道相符,在缺乏AQP1的人与正常人的对照试验中，给予相同剂量的生理盐水后，缺乏AQP1的患者的肺泡气道增厚程度比正常人小。

综上所述，肺水肿是FES肺损伤过程中重要的一环，并且AQP1在肺水肿的发展过程中起到了一定作用。由于肺的水转运涉及到多种AQPs、离子通道,AQP1与它们的协同关系以及AQP1的具体调控以及信号通路还有待研究和阐明，以便更好地了解FES肺损伤的发生过程和机制。

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Changes and Significance of Aquaporin 1 Expression in Mice Models of Fat Embolism SyndromeTIANKun，LIUXi，ZHANGYi-wei，WANGAi-zhong．(DepartmentofAnesthesiology，ShanghaiSixthPeople′sHospitalofJiaotongUniversity，Shanghai200233，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the role of aquaporin1(AQP1) in pathologic process of lung injury in mouse models of fat embolism syndrome(FES)．Methods①A total of 96 healthy male C57BL/6J mice were assigned to control group and FES group which was grouped by 4，6，12，24，and 48 hours with 16 mice per group，according to the random number table．Allogeneic perinephric fat was injected to rat caudal veins in FES groups while the control group was given the same volume of physiological saline．Lung samples were obtained from each group at different time points,to do the hematoxylin and eosin staining,and measure lung wet/dry ratio(W/D) changes.Expression of AQP1 was detected by western blot and immunohistochemistry．②Additional 24 C57BL/6J mice were divided into control group，FES 24 hour group，and AQP1 inhibitor group according to the random number table，with 8 mice per group．Pathologic process of FES-induced lung injury was detected after the inhibition of AQP1．Results①Lung W/D value was 5.19±0.34,5.53±0.24,5.81±0.54,5.77±0.47,5.35±0.15 at 4，6，12，24，and 48 hours respectively， higher than 4.30±0.47 in the control group(P<0.05)．The values of expression of AQP1 in control ，4 h，6 h，12 h，24 h，48 h group were 0.85±0.25，1.00±0.30，0.98+0.39，0.66±0.20，2.02±0.65，1.26±0.35. Expression of AQP1 was at 24 hours in FES group was statistically higher than the control group(P<0.05)．②The W/D values of FES 24 hgroup,AQP1 inhibitor group,control group were 5.70±0.35,4.71±0.13，4.31±0.37，W/D value observed in AQP1 inhibitor group was statistically significantly lower than in FES 24 h group(P<0.05)，but still higher than the control group(P<0.05)．ConclusionAQP1 may play an important role in the progress of lung injury induced by FES,and inhibition of AQP1 is helpful to alleviate the edema caused by FES lung injury.

Key words：Fat embolism; Lung injury; Aquaporin 1

收稿日期：2015-05-24修回日期：2015-07-30编辑：伊姗

基金项目：国家自然科学基金(81272147)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.048

中图分类号：R36

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)22-4159-03