离心操作对BIOLOG法测定微生物群落功能多样性的影响

李玉梅，罗明奇，潘国勇，陶千冶

1.中国科学院计算地球动力学重点实验室，北京 100049 2.中国科学院大学地球科学学院，北京 100049



离心操作对BIOLOG法测定微生物群落功能多样性的影响

李玉梅1，2，罗明奇1，2，潘国勇1，2，陶千冶1，2

1.中国科学院计算地球动力学重点实验室，北京 100049 2.中国科学院大学地球科学学院，北京 100049

陆地生态系统的有机质分解是地球系统碳循环的重要环节，但目前人们对这一过程的认知程度尚待提高，原因之一是对植物凋落物分解时微生物群落功能多样性的变化缺乏系统认识。如能将BIOLOG微平板法引入植物凋落物降解初期的研究中，将弥补这一重要环节的缺失。但当前对如何在降解初期研究中应用这一方法、尤其是对于在预处理过程中是否应进行离心操作并无定论。为此，笔者选用北京桦树林区凋落物的淋洗液为接种液，考察离心操作对BIOLOG微平板法测定结果的影响。研究发现：离心操作能减小培养液的浊度(吸光度减小0.13)、降低溶液颜色对微孔显色程度的干扰，但也会导致测得的微生物群落数量减少(平均颜色变化率可降低约0.4)；样品中微生物群落数量越小，群落功能多样性受影响的程度则越大。因此，在选择是否进行离心操作时，需针对具体的研究对象综合选择。

BIOLOG；离心；凋落物；微生物群落；功能多样性

0 引言

在地球系统碳循环研究中，人们对陆地分解作用的过程、机制和效应的了解尚待深入。在分解作用(尤其是中低纬区)中起关键作用的微生物组合复杂多变、测定难度大是导致人们对其认识不足的重要原因之一。

BIOLOG微平板法[1-2]是与变性梯度凝胶电泳法[3]近乎同时应用于微生物生态学的研究手段。BIOLOG微平板法通过测试微生物对单一碳源的利用程度来反映微生物群体水平的群落结构、测定微生物群落的功能多样性[4-7]。其优点是简便、快捷、灵敏度高、分辨率强[4]，已被广泛应用于土壤[1,8-16]、水体[1,17-19]、活性污泥[20-21]的微生物群落功能多样性研究中，但在新鲜凋落物和半分解层凋落物研究中鲜有使用。若能被引入植物凋落物降解初期的研究中，将有望增强对这一重要环节的认识。欲将BIOLOG法应用于凋落物分析中，必须先充分开展方法学研究。

BIOLOG法的使用基于微孔中溶液的显色程度[1-2]；因此，培养液含有的干扰物质会直接影响平板显色结果。前人[22-26]研究土壤样品时对接种液浓度选择、离心操作等的试验表明，较高的接种密度利于BIOLOG平板更客观地反映微生物群落信息[22,26-27]。然而，接种液浓度越高，由样品本身所含可溶性有机质产生的额外的颜色变化也越大[28]。虽然离心操作能在一定程度上减少样品稀释液中的有机悬浮颗粒，但上清液中细菌和真菌菌丝也会有不同程度的损失[26-27]；会导致样品接种液中的可培养微生物物种减少[29-30]。

离心操作中，溶液中微生物数量减少主要有两种途径：其一是游离的菌体受到离心力作用而自主沉降；其二是细菌个体和真菌菌丝体附着在土壤悬浮颗粒上，伴随悬浮颗粒而沉降。由于大量微生物附着在土壤悬浮颗粒上，因此对土壤样品稀释液进行离心操作时，很难区分这两种沉降效应。

那么，在凋落物的处理过程中，离心操作具体将产生怎样的影响，影响程度又如何呢？

为回答这一问题，笔者尝试用凋落物的淋洗液作为微生物培养液，尽量避免悬浮颗粒对微生物个体的吸附作用；在探讨BIOLOG法测定凋落物微生物群落功能多样性的过程中，通过控制离心操作来观察离心与否对培养液可溶性有机质和可培养微生物群落数量产生的影响，以求为今后的研究工作寻找最佳技术路线。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样地点位于北京东灵山地区(39° 48′ N, 115° 24′ E)一次生林东坡，海拔1 500～1 600 m，主要植被有白桦(Betulaplatyphylla)、辽东栎(Quercusliaotungenisis)和蒙古栎(Quercusmongolicus)，另有少量五角枫(Acermono)和胡桃楸(Juglansmandshurica)伴生。

根据凋落物的新鲜程度和物理性状差异，可区分新鲜凋落物层(fresh litter layer, F)和半分解凋落物层(fragmented litter layer, R)。其中：F层为新鲜黄色或轻微变色的未分解凋落物，叶片基本完整，仅局部有微小破损，干燥易碎；R层为中度到强度破碎成片段的凋落物，叶脉可见，叶肉呈棕黑色，湿度大。二者分层清晰，外观差别明显。

用五点取样法分别采集F层和R层样品，装入信封后立即封口，用冷藏箱带回实验室，在4 ℃冰箱内暂时保存备用。

1.2 实验方法

准确称取相当于5 g干物质质量的凋落物，置于95 mL无菌NaCl溶液(0.85%)中，振荡摇匀30 min，每个样品均设置未离心(分别记为F-1，R-1)和离心(分别记为F-2，R-2)两组不同处理，其中做离心处理的相对离心力为1 500 g，离心时间为10 min。在超净台中，用10倍稀释法将样品淋洗液浓度稀释至10-3梯度。移取150 μL样品稀释液于预热至25 ℃的BIOLOGTMECO板微孔后，25 ℃避光恒温培养228 h，每隔12 h在BIOLOG读数器上读取590 nm和750 nm两波段下的吸光度值。对微生物群落第72 h的CLPP进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和多样性指数分析[6,31-32]。样品测定在中国科学院生态环境研究中心系统生态重点实验室完成。

1.3 数据统计

微生物代谢活性用590 nm(颜色+浊度)与750 nm(浊度)两波段处吸光度的差值表示[33]。计算微孔的平均颜色变化率(average well color development,AWCD)：

其中，Ci，Ri分别为反应孔和对照孔在两波段处吸光度的差值。当(Ci-Ri)<0.06时以0值计算。

分别用Microsoft®Excel2003和SPSS对实验数据进行方差分析和主成分分析。

2 结果

2.1 离心操作对样品培养液浊度的影响

BIOLOGTMECO微平板的对照孔(A1，A5，A9)中无单一碳底物，其在波长750 nm[33]处吸光度的变化可以指示培养液浊度的变化、追踪浊度对平板显色的干扰程度。

R层的吸光度总体高于F层(图1)，反映其浊度总体高于F层。分别比较F-1与F-2、R-1与R-2两组曲线(图1)发现：进行离心操作与否，F层稀释液的吸光度几乎无变化，反映其浊度无变化；但R层的浊度则对离心操作较为敏感，离心操作后，其稀释液的吸光度减小约0.13。

图1 凋落物层微生物培育过程中微孔吸光度变化Fig.1 Variations of absorbance of micro pores in the proass of microbial communities overtime in BIOLOGTM ECO micro-plates

2.2 离心操作对微生物群落功能多样性的影响

2.2.1 AWCD曲线

从BIOLOGTMECO微平板展示的平均颜色变化率曲线(图2)可以看出：总体上，R-1、R-2曲线明显高于F-1、F-2曲线；F-2曲线明显低于F-1曲线，而R-2曲线略低于R-1曲线。

图2 凋落物层微生物培育过程中AWCD变化Fig.2 Variations of AWCD over time in the process of microbial communities in BIOLOGTM ECO micro-plates

可见，采用离心操作的凋落物样品，微生物群落代谢单一碳底物的总能力较低。离心操作对半分解层凋落物层微生物群落的影响比较小，而对新鲜凋落物层的影响较为明显。

2.2.2 多样性指数

BIOLOGTMECO微平板上，微孔中单一碳底物的代谢种类和数量直接反映了微生物群落结构特征，平板上呈现的代谢碳源的差异是微生物群落特征差异的反映。

从微生物群落功能多样性指数(表1)可以看出，R层凋落物微生物群落多样性指数稳定，是否进行离心操作对其没有明显影响；而F层微生物群落的丰富度指数(H′)则因采用离心操作而显著降低，均匀度指数(E)也略有减小。

表1 微生物群落功能多样性指数①

Table 1 Functional diversified indices of microbial communities in litter fall

H'②N③E④n⑤F-12.71±0.02200.90±0.013F-21.64±0.1770.87±0.034R-13.21±0.02290.96±0.016R-23.21±0.04290.95±0.006

注：①H′、E数据格式为样本平均值±标准偏差；②Shannon丰富度指数H′=-∑(Piln(Pi))，Pi为第i孔相对吸光值(Ci-Ri)与整个平板相对吸光值总和的比率[34]；③N为BIOLOGTMECO板上微生物利用碳源的数目；④Shannon均匀度指数E=H′/ln(S)，S为板中颜色变化孔的数目[34]；⑤n为样本重复数。

2.2.3 PCA成分图

微生物群落代谢碳源特征在主成分分析图(图3)上得到分离。其中：PC1表示第一主成分，其方差贡献率为66.2%，即所占信息总量为66.2%；PC2表示第二主成分，其方差贡献率为11.6%。F层和R层分别分布在PC1的正负两端(图3)，起分异作用的首要碳底物为D-葡萄糖、聚合物和羧酸类物质(表2)。离心操作对新鲜凋落物微生物代谢多样性的影响主要体现在PC2上，羧酸、糖类和双性化合物是引起分异的主要碳源(表2)。离心操作对半分解层凋落物微生物代谢多样性的影响。

3 讨论

总体上，进行离心操作，半分解层凋落物微生物群落多样性指数几乎不受影响，代谢单一碳底物的总能力有所下降，浊度则明显降低。新鲜凋落物除浊度不受影响外，其他参数均有不同程度的降低。

图3 微生物群落碳源利用特性的主成分分析图Fig.3 Principal component analysis of microbial communities in fallen leaves for sole carbon sources

对照孔浊度在前36 h的增幅较大，之后趋于平稳(图1)。这可能是由于微生物短期内利用培养液中含有的有机质进行生命代谢、微孔内微生物群落数量增多造成的。当可利用的有机质消耗殆尽，微生物生命代谢变弱，群落数量逐渐稳定。这一现象也证明，微生物会利用培养液本身的有机质，导致额外的颜色反应[28]，干扰平板显色结果。

F层凋落物经历风化、分解时间较短，破碎程度很小；而R层凋落物经历一定时期(本试验采集凋落物样品为400～460 d)的分解过程，破碎程度大，可溶性有机成分和细小颗粒含量较多[35-38]，微生物群落数量也多。因此，半分解层凋落物的微生物群落活性高于新鲜凋落物。同时，这也是导致半分解层凋落物离心(1 500 g, 10 min)后溶液浊度减小幅度较大(图1)的原因。

表2 BIOLOGTM ECO微平板上PC1和PC2的主要负荷因子碳源

注：R为主成分和相应原先变量的相关系数。

从微生物代谢碳源的数量和类型看，离心操作并没有对半分解层凋落物微生物群落产生明显影响，但对新鲜凋落物层微生物群落代谢碳源的总能力和多样性均有显著影响(图2，3；表1)。

4 结论

当研究对象可溶有机质含量高、微生物群落数量丰富时，离心操作能降低培养液本身产生的额外颜色变化和溶液浊度对显色程度的干扰，且对微生物群落功能多样性无明显影响，故推荐使用离心操作；当研究对象可溶有机质含量低、微生物群落数量较少时，离心操作可能导致测得的群落功能多样性减小，故不推荐使用。简言之，离心操作适用于培养液中有机质含量较高且微生物群落数量丰富的样品。在实际工作中，应针对研究对象和研究目标进行选择。

感谢中国科学院生态环境研究中心系统生态重点实验室郑华研究员对测定工作的指导和帮助。

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Centrifugation Effect on the Functional Diversity of Microbial Community in Fallen Leaves Displaying in BIOLOG Micro-Plates

Li Yumei1,2, Luo Mingqi1,2, Pan Guoyong1,2, Tao Qianye1,2

1.KeyLaboratoryofComputationalGeodynamics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China2.CollegeofEarthScience,UniversityofChineseAcademySciences,Beijing100049,China

The decomposition of organic matter in terrestrial ecosystem is an important link in the global carbon cycle; however, and the knowledge of this process are still not sufficient. One of the reasons is the lack of a systematical recognition to the changes of microbial community functional diversity during a decomposition of plant litter. Things will get better if the method of BIOLOG micro-plates can be introduced into the initial degradation process of plant litter. Unfortunately, there was no conclusion on how to use this method to the initial degradation, and whether a centrifugal operation should be used during the process of pretreatment. We choose the eluting solution of Beijing birch forest litter as inoculums and consider the effects of centrifugal operation on the BIOLOG micro-plates. The results show that centrifugation can reduce the turbidity (absorbance decreases 0.13) and the interference of color to the solution. At the same time, centrifugation could reduce the measured quantity of microbial communities (AWCDvalue can be reduced by 0.4). The less the quantity of microbial communities in the sample is, the greater the impact on the functional diversity of soil microbial communities is. Therefore, a specific study target should be the judging basis to determine whether a centrifugation is used for its pretreatment.

BIOLOG；centrifugation；leaf litter；microbial community；functional diversity

10.13278/j.cnki.jjuese.201504206.

2014-10-28

中国科学院战略性先导科技专项项目(XDA05130402)；国家自然科学基金项目(41272207，40772112)；中国科学院知识创新工程重要方向项目(KZCX2-EW-QN601)

李玉梅(1974--)，女，副教授，主要从事地球化学、地球生物学和第四纪地质学方面的研究，E-mail:liym@ucas.ac.cn。

10.13278/j.cnki.jjuese.201504206

S718.43

A

李玉梅，罗明奇，潘国勇，等.离心操作对BIOLOG法测定微生物群落功能多样性的影响.吉林大学学报:地球科学版,2015,45(4):1198-1204.

Li Yumei, Luo Mingqi, Pan Guoyong, et al. Centrifugation Effect on the Functional Diversity of Microbial Community in Fallen Leaves Displaying in BIOLOG Micro-Plates.Journal of Jilin University:Earth Science Edition,2015,45(4):1198-1204.doi:10.13278/j.cnki.jjuese.201504206.