SPE-UHPLC测定淀粉及淀粉制品中丁烯二酸类酸度调节剂

别 玮, 李小林, 张朝晖, 郝 欣

（北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，北京 100026）

SPE-UHPLC测定淀粉及淀粉制品中丁烯二酸类酸度调节剂

别 玮, 李小林, 张朝晖*, 郝 欣

（北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，北京 100026）

建立固相萃取-超高效液相色谱法测定淀粉及淀粉制品中的顺丁烯二酸、顺丁烯二酸酐和反丁烯二酸含量的检测方法。样品经ProElut PWA混合型弱阴离子交换固相萃取柱净化，超高效液相色谱分析，采用Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱，洗脱液为φ（磷酸）=0.10%水溶液与甲醇的体积比为98∶2，检测波长214 nm，流速0.2 mL·min-1。在此条件下，顺反丁烯二酸分离良好且无杂质峰干扰，样品加标回收率83.81%～108.03%，相对标准偏差（n=8）小于10%，顺丁烯二酸和反丁烯二酸的定量限为0.25 mg·kg-1，能够满足实际检测需要。

淀粉；顺丁烯二酸；反丁烯二酸；顺丁烯二酸酐；固相萃取；超高效液相色谱

淀粉是指以谷类、薯类、豆类为原料，不经过任何化学方法处理，也不改变淀粉内在的物理和化学特性加工制成的食用淀粉，包括谷类淀粉、薯类淀粉和豆类淀粉［1］。淀粉是葡萄糖的高聚体，在餐饮业又称芡粉。人类膳食中最为丰富的碳水化合物就是淀粉。淀粉制品是指以谷类、薯类、豆类或其制成的食用淀粉为原料，经多道工序加工制成的淀粉制品，包括粉丝、粉条、粉皮［2］。

顺丁烯二酸俗称马来酸（maleic acid），顺丁烯二酸酐俗称马来酸酐（maleic anhydride），可用于制造食品接触的包装材料［3］。我国食品安全国家标准GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》未将顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐列为食品添加剂，它们属于非法添加物。由于顺丁烯二酸酐与食用淀粉结合后可产生糊化温度低、黏度高、稳定性好、黏胶性强的改性淀粉，因此不法生产商将顺丁烯二酸酐添加到食品级改性淀粉中，用以增加食物的弹性、黏性及外观光亮度。反丁烯二酸又称富马酸（fumaric acid），在食品、医药和化工等领域广泛运用。反丁烯二酸是GB 2760—2011中允许使用的食品添加剂，常用作酸度调节剂，可用于生湿面制品、焙烤食品馅料及表面用挂浆、面包、糕点、饼干等含淀粉类食品，在饼干和糕点中最大使用量为3.0 g/kg［4］。

2013年5月13日，台湾地区“卫生署”发布公告，多家台湾食品生产企业生产的粉圆等食品中检测出顺丁烯二酸，经查证确认系淀粉中违法使用顺丁烯二酸酐所致。据调查，顺丁烯二酸（酐）在大陆也发现大量出售信息，并且不少以食品添加剂的名义出售。顺丁烯二酸酐遇水会转化成顺丁烯二酸，顺丁烯二酸对人体会产生一定危害，据欧盟评估资料，成人每公斤体重顺丁烯二酸的每日耐受量（tolerable daily intake，TDI）为0.5 mg，以60 kg的成年人计算，每日食用量不应超过30 mg［3］。

上述事件曝光后，顺丁烯二酸（酐）的检测成为关注焦点，但由于顺丁烯二酸和食品中允许使用的反丁烯二酸互为同分异构体，分子量和分子式相同，理化性质近似，吸收光谱图也一致，在检测中容易出现假阳性。因此，在检测顺丁烯二酸的同时，需要同时检测反丁烯二酸，以减少误判，因此研究建立多种食品中顺丁烯二酸（酐）和反丁烯二酸的检测方法具有重要的现实意义。

近年来，反丁烯二酸作为食品中的酸度调节剂应用较广，因此国内外有关食品中对其含量检测的文献报道较多［5-10］，但对于分离检测淀粉和淀粉制品中反丁烯二酸含量的报道不多。顺丁烯二酸（酐）的检测方法主要集中在色谱法［11-15］，我国现有的国家标准GB/T 23296.21—2009也是采用高效液相色谱及内标法对食品模拟物中顺丁烯二酸及顺丁烯二酸酐进行分离与测定［14］。但文献报道的色谱法检测顺丁烯二酸（酐）的前处理不适于复杂基质。本文针对前处理方法进行了系统的研究，建立了适用于淀粉和淀粉食品中顺丁烯二酸、顺丁烯二酸酐和反丁烯二酸含量测定的固相萃取-超高效液相色谱分析方法，方法易于操作，便于推广。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ProElut PWA型固相萃取小柱（500 mg/6 mL），中国迪马科技；HSS T3型Waters Acquity色谱柱，（2.1 mm×150 mm×1.8 μm），美国Waters公司；0.2 μm微孔滤膜（Whatman，nylon，Puradisc 13），美国GE公司；甲酸，φ=96%，色谱纯，美国ROE公司；氨水，分析纯，北京化工厂；乙腈，色谱纯，美国Fisher公司；甲醇，色谱纯，美国Fisher公司；超纯水，自制；磷酸，色谱纯，中国迪马科技。

标准物质顺丁烯二酸和反丁烯二酸，纯度均大于99.0%，美国Arocs公司。由于顺丁烯二酸酐遇水即水解，在提取后仪器实际检测的为顺丁烯二酸，所以购买的标准品仅为顺丁烯二酸。

实验所选用样品的面条、粉丝、芋圆、珍珠粉圆、木薯淀粉、红薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦粉等均购自超市。

1.2 仪器与设备

Nexera LC-30A型超高效液相色谱仪，配有二极管矩阵紫外检测器及数据处理系统，日本Shimadzu公司；3k15型高速冷冻离心机，德国Sigma公司；KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MS 3 basic型旋涡混合器，德国IKA公司；Milli-Q型超纯水仪，美国Millipore公司；Omni THQ型数字组织均质机，美国Omni公司；电子分析天平（感量0.000 1 g），德国Sartorius公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别准确称取顺丁烯二酸和反丁烯二酸，用超纯水溶解后，容量瓶定容，配成500 mg/L的标准储备液，4℃冷藏。使用前用φ（磷酸）=0.1%水溶液分别稀释制0.10，0.20，0.50，1.00，5.00，10.00，20.00，30.00，50.00 mg/L的标准工作溶液。

1.3.2 样品前处理

芋圆、珍珠粉圆属于黏性大的淀粉样品是准确称取样品2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入甲酸水溶液（pH值=5）25 mL，用组织均质机在提取液中均质样品2 min。

红薯淀粉、粉丝等其他黏性小的淀粉样品是固体类的淀粉样品用粉碎机磨碎后，准确称取样品2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入甲酸水溶液（pH值=5）25 mL，用旋涡混合器涡旋2 min混匀。

将处理过的样品超声提取10 min后，离心，取上清溶液5 mL于ProElut PWA柱（预先用5 mL甲醇、5 mL φ（甲酸）=2%的水溶液活化处理过），以1 mL·min-1的流速过柱，再依次加入淋洗液5 mL φ（甲酸）=2%水溶液、5 mL乙腈和5 mL甲醇，用10 mL φ（氨水）=8%的甲醇溶液洗脱，控制洗脱液流速不超过1 mL·min-1，收集洗脱液，在45℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL φ（磷酸）=0.1%水溶液复溶，溶液经0.2 μm微孔滤膜过滤，滤液供UHPLC分析。

1.3.3 色谱条件

流动相φ（磷酸）=0.10%水溶液与甲醇的体积比为98∶2；流速0.2 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL；检测波长214 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择

用反相色谱分析顺丁烯二酸、反丁烯二酸时，为了使分析物尽可能地以分子形式存在，通常需控制流动相的pH值来抑制其离子化，使其在反相柱上得到保留，从而达到分离的目的。通过文献检索，常用的流动相为磷酸盐和磷酸水溶液，分别考察了磷酸二氢钾（用磷酸调节pH值为3.0）和φ（磷酸）= 0.1%水溶液这2种流动相，色谱峰峰型和分离度均较好，但φ（磷酸）=0.1%水溶液配制简单易行，所以实验选用φ（磷酸）=0.1%水溶液为流动相。

2.1.2 色谱柱的选择

考察了Phenomenex Luna C18色谱柱和Waters HSS T3色谱柱，结果表明，混合标准品进样时，Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱能较好地分离待测组分。后者显示出对极性化合物具有更好的保留同时对非极性化合物不产生过强的保留，它能够耐受100%的纯水流动相不会出现“柱塌陷”的问题，而且在低pH流动相条件下具有极好的柱寿命。结合待测化合物极性和流动相条件，选择Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱。

2.2 提取条件的选择

2.2.1 对高黏性基质的处理

某些淀粉类食品如芋圆、珍珠粉圆等熟制后黏性较大，用粉碎机粉碎效果较差，在提取液中分散效果也不好，不利于目标化合物的提取。针对上述问题，采用Omni THQ数字组织均质机在提取液中对上述样品进行均质，可使基质均匀分散于提取液中，可得到较好的提取效果。

2.2.2 提取液的选择

结合文献和顺丁烯二酸、反丁烯二酸的理化性质，对水、φ（乙醇）=5%水溶液、φ（甲酸）=2%水溶液和pH值=5甲酸水溶液这4种提取液对淀粉及淀粉制品的阴性加标样品的提取效率进行考察，结果如图1，φ（甲酸）=2%水溶液（pH值=2.5）和pH值=5甲酸水溶液对顺、反丁烯二酸的提取率均能达到90%以上，由于顺丁烯二酸的pKa1=1.92，pKa2=6.23，反丁烯二酸的pKa1=3.02，pKa2=4.38，为使顺丁烯二酸和反丁烯二酸在提取液中尽可能的离子化，有利于下一步的固相萃取净化，选择pH值=5甲酸水溶液。

2.3 固相萃取条件的优化

2.3.1 固相萃取柱的选择

鉴于顺丁烯二酸和反丁烯二酸的pKa值，实验分别考察了Oasis WAX、Oasis HLB、ProElut PWA、Strata SAX和Strata X-AW这5种固相萃取柱对顺丁烯二酸和反丁烯二酸回收率的影响，结果如图2，ProElut PWA对顺丁烯二酸和反丁烯二酸的回收率都能达到80%以上，故选择ProElut PWA固相萃取柱。

图1 不同提取溶剂对提取效率的影响Fig.1 Effects of different extraction solutions on extraction yield

图2 固相萃取小柱对顺丁烯二酸和反丁烯二酸回收率的影响Fig.2 Effects of different solid phase extraction cartridges on recoveries of maleic acid and fumaric acid

2.3.2 洗脱溶剂及用量对回收率的影响

对于混合型弱阴离子交换小柱，常见的洗脱溶剂为φ（氨水）=5%甲醇溶液，但对目标化合物的回收率稍差，在70%～76%之间。因此考虑增加氨水浓度，配制8%氨水甲醇溶液能够将目标化合物完全洗脱，回收率在85%～97%之间，但洗脱液pH值偏大，因此采用流动相0.1%的磷酸水溶液进行复溶后上机，可避免目标化合物在碱性条件下出现离子化现象。

实验对洗脱液的用量进行了研究，以3 mL为单位，分别收集3，6，9，12 mL的洗脱液时，回收率分别为54.61%，74.32%，94.64%和96.18%，所以实验选择洗脱液体积为10 mL，既节省溶剂，又提高了检出限。

2.4 线性范围、标准曲线和定量限

分别配制一系列浓度的顺丁烯二酸和反丁烯二酸的混合标准溶液按1.3.1节进行配制，顺丁烯二酸的回归方程y=86 610.0x-5 344.64，相关系数0.9997，线性范围0.10～50 mg/L，定量限0.25 mg/kg；反丁烯二酸的回归方程y=110 202x+2 505.95，相关系数0.999 6，线性范围0.10～50 mg/L，定量限0.25 mg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度测定

选取马铃薯淀粉、红薯淀粉、小麦粉、木薯淀粉、玉米淀粉、粉丝、面条、芋圆和珍珠粉圆共9种样品基质，分别添加一定量的顺丁烯二酸和反丁烯二酸的标准溶液，按1.3节方法进行3个水平的加标回收率测定，每一加标水平平行测定5次，考察方法的回收率和精密度，同时做样品空白实验。结果表明，不同样品在不同加标水平下的回收率较稳定。加标回收率和精密度见表1。标准品的超高效液相色谱见图3。图4为加标样品直接进样和加标样品净化后进样的色谱图比较，由图可看出，净化后的样品基质干扰显著降低，杂质峰个数明显减少。

表1 顺丁烯二酸和反丁烯二酸在9种样品基质中的回收率和相对标准偏差Tab.1 Recoveries and RSDs of maleic acid and fumaric acid in spiked samples

2.6 实际样品的检测

利用本方法对市场上采购的玉米淀粉（2份），马铃薯淀粉（2份），木薯淀粉（2份），粉丝（2份），鱼丸（2份）和芋圆（2份）进行顺丁烯二酸（酐）和反丁烯二酸含量的测定，未发现有非法添加顺丁烯二酸的样品，添加反丁烯二酸的检测结果均在GB 2760—2011允许的添加范围内。

图3 0.10 mg·L-1的顺丁烯二酸和反丁烯二酸标准品的超高效液相色谱图Fig.3 UHPLC/DAD chromatogram of 0.10 mg·L-1maleic acid and fumaric acid

图4 未经净化处理和经固相萃取净化的1.50 mg·kg-1红薯淀粉加标的超高效液相色谱图Fig.4 UHPLC/DAD chromatograms of 1.50 mg·kg-1maleic acid and fumaric acid in sweet potato starch without/with SPE purification

3 讨论与结论

以上实验结果表明，本方法结合实际应用，以常见的淀粉及淀粉制品，如马铃薯淀粉，玉米淀粉，粉丝和珍珠粉圆等为研究对象，采用固相萃取（SPE）这种简便、快速的样品前处理净化技术和超高效液相色谱法，建立了淀粉及淀粉制品中顺丁烯二酸（酐）和反丁烯二酸的系统、有效且快捷的前处理技术平台和高灵敏度的快速、准确且易操作的含量检测方法。通过对上述各种实验条件的优化选择，本方法的定量限为0.25 mg·kg-1，优于参考文献中给出的定量限（结果比对见表2）［5，11-12］。

表2 与文献的实验结果对比Tab.2 Comparison of experimental results with references

因此，本方法准确性、重复性良好，适用于淀粉及淀粉制品中顺丁烯二酸（酐）和反丁烯二酸的含量的批量检测。

［1］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.关于印发糖果制品等13类食品生产许可证审查细则的通知（国质检监〔2004〕557号）［EB/OL］.（20051026）［20140801］http：∥www.hfgjj.com/n7216006/ n9417014/n9417487/n9423044/n9423277/9473889.html.

［2］Ann C E.Starch in food：structure，function and applications［M］.Cambridge：Woodhead Publishing，2004：57-81.

［3］European Union.No 10/2011 on plastic materials and articles intended to come into contact with food［S］.Aberdeen：Official Journal of the European Union，2011.

［4］中华人民共和国卫生部.GB 2760—2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准［S］.北京：中国标准出版社，2011.

［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 2007—2007进出口果汁中乳酸、柠檬酸、富马酸含量检测方法高效液相色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2007.

［6］Jessika H.Analysis of low-molecular-mass organic acids using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2003，988（1）：127-133.

［7］Silvia S，Inés M，José F H，et al.Rapid determination of minority organic acids in honey by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2002，955（2）：207-214.

［8］Ching Lin Hsu，Wang Hsien Ding.Determination of lowmolecular-weight dicarboxylic acids in atmospheric aerosols by injection-port derivatization and gas chromatogra-phy-mass spectrometry［J］.Talanta，2009，80（2）：1025 -1028.

［9］Mato I，Suárez-Luque S，Huidobro J F.A review of the analytical methods to determine organic acids in grape juices and wines［J］.Food Research International，2005，38（10）：1175-1188.

［10］Stella R，Anna K，Heli S，et al.Determination of the carboxylic acids in acidic and basic process samples by capillary zone electrophoresis［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217（8）：1407-1413.

［11］李红艳，陈万勤，王瑾，等.高效液相色谱法测定淀粉及淀粉制品中的顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐总含量［J］.分析测试学报，2012，31（8）：1013-1016.

［12］蒙泳，黎德勇，甘露，等.高效液相色谱法测定淀粉中的顺丁烯二酸［J］.洛阳理工学院学报：自然科学版，2012，22（2）：1-4.

［13］高翠英，李彦威，贾皓旭.色谱法同时测定富马酸和马来酸的含量［J］.广东化工，2008，35（8）：140-143.

［14］李金昶，赫奕，孙颜，等.用反相高效液相色谱法分离和测定丁烯二酸的顺反异构体［J］.分析测试学报，2000，19（2）：72-76.

［15］中华人民共和国卫生部.GB/T 23296.21—2009食品接触材料高分子材料食品模拟物中顺丁烯二酸及顺丁烯二酸酐的测定高效液相色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2009.

Determination of Maleic Acid and Fumaric Acid in Starch and Starch Products Using SPE-UHPLC Method

BIE Wei， LI Xiaolin， ZHANG Zhaohui*， HAO Xin
（Inspection and Quarantine Testing Center of Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China）

In the present study，a solid-phase extraction ultra high performance liquid chromatographic（UHPLC）method was established for the analysis of maleic acid，fumaric acid，and maleic anhydride in starch and starch products.Starch samples were cleaned up by ProElut PWA mixed-mode weak anion exchanger SPE columns.Waters Acquity UPLC HSS T3 was used for chromatographic separation and the separation condition was 0.10%phosphoric acid aqueous solution and methanol（98∶2，V/V），detection wavelength 214 nm，and flow rate 0.2 mL·min-1.The average spiked recoveries were in the range of 83.81%and 108.03%with RSDs（n=8）less than 10%and the LOQs of maleic acid and fumaric acid were 0.25 mg·kg-1.The method could satisfy with the requirement for the determination of maleic acid and fumaric acid in actual samples.

starch；maleic acid；fumaric acid；maleic anhydride；solid-phase extraction；ultra high performance liquid chromatography

李 宁）

TS237

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.05.009

2095-6002（2015）05-0052-06

别玮，李小林，张朝晖，等.SPE-UHPLC测定淀粉及淀粉制品中丁烯二酸类酸度调节剂［J］.食品科学技术学报，2015，33（5）：52-57.

BIE Wei，LI Xiaolin，ZHANG Zhaohui，et al.Determination of maleic acid and fumaric acid in starch and starch products using SPE-UHPLC method［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（5）：52-57.

2014-09-24

北京检验检疫局科技计划项目（2013BK002）；“十二五”国家农村领域国家科技计划课题（2011BAD23B05-4）。

别 玮，女，工程师，硕士，主要从事食品添加剂和非法添加物检测方面的研究；*张朝晖，男，高级工程师，博士，主要从事食品安全检测方面的研究。通信作者。