缺氧与肿瘤恶性演进的关系及其机制探讨＊

杨庆强，唐春燕

（1.泸州医学院附属医院普外科，四川泸州646000；2.泸州医学院护理学院卫校，四川泸州646000）

绝大多数实体肿瘤中存在低氧微环境，氧分压为0～20 mm Hg，而正常组织则在40 mm Hg以上［1］。低氧微环境与肿瘤的恶性进展、放化疗的耐受性及预后不良密切相关［2-3］。本实验观察低氧下HT-29 细胞分泌的基质金属蛋白酶2／9（MMP-2／9）活性，并检测细胞核内NF-κB的蛋白表达，初步探讨低氧与肿瘤恶性转化的关系及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料 人结肠癌细胞株HT-29由泸州医学院附属医院中心实验室提供；细胞核蛋白／细胞质蛋白抽提试剂盒（百泰克公司）；兔抗人NF-κB多克隆抗体（Neomarkers公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥公司）；明胶（Sigma公司）；RPMI-1640（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；4.8%O2、90.2% N2和5%CO2三元混合气体；低氧培养装置。

1.2 细胞培养 以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养HT-29细胞。分为对照组和低氧组。对照组置于普通常氧下的37 ℃、5%CO2培养箱内培养；低氧条件参照文献［1，4］，在前期的研究中发现持续灌注低流量（4.8%）的O2，培养液O2压力将恒定于20mm Hg（参照体内肿瘤的氧分压水平）。将低氧培养装置置于37 ℃恒温水浴箱内，真空泵抽尽前者的空气，从入气口灌入含4.8% O2、90.2% N2和5% CO2三元混合气体（3.0L／min），并打开出气口阀门，20min后减少混合气流量至0.1L／min，以维持低氧状态，低氧组HT-29细胞置于该低氧装置内培养。

1.3 提取细胞核蛋白及Western blot分析 分别低氧培养0、6、12、24和48h，对照组常氧下培养相应时间，各时相点设8个复孔，实验重复3次。收集细胞后用PBS液漂洗。依照细胞核蛋白／细胞质蛋白抽提试剂盒说明书提取细胞核蛋白，加入添加了苯甲基磺酰氟的CER A，漩涡震荡15s，冰浴15 min，再加入CER B，漩涡震荡5s，冰浴1min，4 ℃12 000×g离心5min，弃上清。对于沉淀，加入添加了苯甲基磺酰氟的NER 并将其分散，冰浴40min，期间每5分钟剧烈涡流15s，再4 ℃12 000×g离心10min，该上清即为细胞核蛋白，吸取后用于检测NF-κB。蛋白样品加入上样缓冲液煮沸5min，离心、上样（20μg／道），行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，再转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。5%脱脂奶粉封闭1h后，加入1∶200稀释的兔抗人NF-κB／p65多克隆抗体，4 ℃过夜，用β-actin作内参照。TBST 洗膜，再加入1∶1 000稀释的辣根酶标记山羊抗兔IgG，37 ℃1h，洗膜，滴加ECL发光试剂，Bio-Rad图像处理系统Hisensitivity模式监测其曝光显影，并测定蛋白条带相对灰度，相对灰度积分值代表蛋白的表达量。

1.4 明胶酶谱分析 HT-29细胞以1×106／孔、含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液接种到六孔板内培养过夜。次日用0.01mmol／L PBS（pH7.4）洗涤后，加入无血清RPMI-1640。分别低氧培养0、6、12、24 和48h，对照组常氧下培养相应时间，各时相点设8个复孔，实验重复3次。收集各时段点上清液，按照1∶3比例将上清液与上样缓冲液（62.5mmol／L Tris-Hcl pH6.8，10%甘油，2%十二烷基硫酸钠，0.1%溴酚蓝）混合，进行1.5%明胶／8%PAGE、80V 电泳20min、100V 电泳2h。2.5%Triton X-100洗脱凝胶，加入50mmol／L Tris-Hcl pH7.5，0.2 mol／L NaCl，5 mmol／L CaCl2，0.02% Triton X-100，37 ℃孵育24h，再经0.4%考马斯亮蓝R-250、10%冰醋酸、20%甲醇的染色缓冲液和10%冰醋酸、20%甲醇的脱色缓冲液处理，直至凝胶显现出蛋白负染条带。对负染条带用Bio-Rad的图像处理系统进行扫描分析，负染条带的大小、亮度代表MMP-2／9的相对表达量。

1.5 统计学处理 采用SAS9.0软件进行统计分析，计量资料用±s表示，行方差分析或t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 低氧下细胞核内NF-κB 蛋白的表达 在常氧下的对照组，HT-29细胞核内的NF-κB／p65表达呈低水平。在低氧组，低氧最初6h，HT-29细胞核内的NF-κB 表达无显著变化，低氧12h后逐渐升高，24h达到顶峰。低氧各时段组（除6h组外），NF-κB蛋白的表达均显著高于对照组。见图1。

图1 低氧组及对照组细胞核内NF-κB／p65蛋白表达水平

2.2 低氧下MMP-2、MMP-9的活性 MMP-2及其前体溶解明胶后呈现分子量为66×103／72×103的负染条带，MMP-9则呈现92×103的负染条带，HT-29细胞分泌的MMP活性以MMP-2及其前体为主。明胶酶谱分析可检测出HT-29细胞在常氧下可分泌一定活性的MMP-2及其前体和MMP-9，低氧最初6h，MMP-2、MMP-9 活性无显著变化。低氧12h，HT-29细胞分泌的MMP-2、MMP-9活性逐渐上调，24h达顶峰。低氧各时段组（除6h组外），MMP-2、MMP-9活性均显著高于对照组（P＜0.01），见图2。由此可见，低氧可诱导HT-29细胞分泌的高活性的MMP2、MMP-9。

图2 明胶酶谱分析MMP-2／9活性

3 讨 论

在人和小鼠的肿瘤组织中，距离血管50～250mm 处即可观察到低氧细胞［5］。肿瘤细胞更倾向于糖酵解，即使在氧气充足的情况下依然会进行糖酵解，这一过程被称为Warburg effect［6］。糖酵解过程产生的乳酸会使肿瘤细胞处于酸性微环境，这一现象在肿瘤低氧区表现得更为明显，实验表明，低氧肿瘤细胞内pH 值约为7.05，而正常值为7.30。因此，低氧是实体肿瘤物理外环境的典型特征。

细胞外间质的微环境对实体肿瘤的恶性表型起着重要的调控作用。癌细胞对低氧的耐受以及演进主要依赖缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）来进行调节。此外，生物体内还存在非HIF信号转导通路，从而形成了细胞对低氧应答的特异性和多样性。

本研究用低氧环境培养HT-29细胞并提取细胞核蛋白，以Western blot分析其细胞核NF-κB的表达水平，发现在低氧12h后，细胞核中的NF-κB开始升高，低氧24h，细胞核中的NF-κB已显著增加，并达到顶峰。正常情况下NF-κB 以同二聚体或异二聚体存在，并和抑制性蛋白IκB 呈非共价结合而不能发生核转位。IκB 蛋白泛素化和磷酸化后可激活NF-κB 蛋白，但其活化过程受严格调控。一旦IκB 被磷酸化，IκB 被含Cull（Cullin蛋白的一种）的多聚泛素连接酶泛素化，进而通过蛋白酶体途径降解，NF-κB与IκB分离，暴露出核定位信号，激活NF-κB，游离的NF-κB 二聚体进入细胞核，在大量激活子的作用下，NF-κB 复合体与同源DNA 序列结合产生基因表达的效应［7］。本研究表明：在低氧诱导下，HT-29细胞质中的NFκB可能经某些因素的作用，从细胞质向细胞核转位，具有转化活性、位于细胞核的NF-κB进一步上调其下游基因。

低氧条件会诱导癌细胞分泌许多MMPs和血纤维蛋白溶酶原抑制因子1（PAI-1）等破坏细胞外基质的分子［8-9］，从而向基底层扩散、浸润。

在肿瘤的浸润、转移中，MMP-2／9所起的作用主要取决于其活性。本实验的明胶酶谱分析显示：低氧最初6h，MMP-2／9活性无显著变化。低氧12h，HT-2／9细胞分泌的MMP-2／9活性逐渐上调，24h 达顶峰。低氧各时段组（除6h 组外），MMP-2／9活性均显著高于对照组。高活性的MMP-2／9降解Ⅳ型胶原，为HT-29细胞浸润、转移提供通道。MMPs因为缺乏缺氧反应元件（HRE）不受缺氧诱导因子的调控，这与尿激酶型胞浆素原活化物（uPA）有所不同。鉴于此，低氧时可能存在另外一条非HIF-1α的途径调控肿瘤细胞的侵袭能力。当整合素受体α1β3被激活后，可活化NF-κB，并使其转位至细胞核内与MMP-9启动子结合，上调MMP-9的表达；NF-κB还可上调MT1-MMP的表达，使MMP-2的活性进一步增强［10-11］。Li等［12］也报道，在低氧条件下，通过NF-κB／HIF-1α途径可上调MMP-2／9的表达。

低氧几乎影响整个肿瘤细胞的功能以及改变大多数信号转导途径的活性，这些信号途径并不是孤立存在的。肿瘤细胞在适应低氧并演进过程中，需要多条信号通路的协调，如HIF-1 与NF-κB 协同作用：一方面，HIF-1可以激活NF-κB；另一方面，低氧激活NF-κB，NF-κB 转入核内又能与HIF-1α 启动子区域结合，上调HIF-1amRNA 和蛋白水平［13］。此外HIF-1的激活还需要NF-κB 和低氧后翻译后调节机制的共同调节［14］，如此形成肿瘤细胞低氧应答的组织特异性和多样性。本实验发现：在低氧的诱导下细胞核中NF-κB和MMP-2／9的活性明显上调，且上调趋势同步。因此推测：不同与HIF-I，NF-κB可能是低氧下的另一重要调控途径，可通过上调MMP-2／9的活性使肿瘤细胞的侵袭性增加。

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