卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF65抗体的制备及其特异性检测＊

陈源红，赵丽娟，梁有龙，张卓华，曾 怡△

（右江民族医学院：1.微生物学与免疫学教研室；2.临床本科2011级8班，广西百色533000）

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus，KSHV）由Chang等［1］在1994年首先从AIDS相关型Kaposi′s肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）患者的肉瘤组织发现，又称 人 类8 型 疱 疹 病 毒（human herpesvirus-8，HHV-8）。KSHV 与原发性弥漫性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）、多中心浆细胞增多症（multicenter castleman′s disease，MCD）等恶性肿瘤发生密切相关［2］。此外，研究发现KSHV是卡波氏肉瘤发生的必需因素［3］。KS是一种少见的软组织恶性多发性出血性血管肉瘤。临床上分为4 型即经典型KS、AIDS相关型KS、非洲型KS及免疫抑制型KS［4］，因此，KS为艾滋病患者好发肿瘤之一。来源于体腔B 淋巴细胞瘤的BCBL-1细胞携带KSHV。KSHV 在宿主细胞内的复制周期分潜伏和裂解复制感染2个阶段，其中，ORF65蛋白是病毒衣壳蛋白，在病毒裂解期表达并可诱导机体产生特异免疫应答，并且在KSHV 6 种衣壳蛋白中与其他疱疹病毒同源性最低［5-6］。因此，ORF65 蛋白是KSHV 病毒检测及其疫苗研究制备的靶抗原，是目前KSHV 研究前沿热点之一。为获得高效价的ORF65蛋白抗体，本研究利用ORF65蛋白，通过免疫家兔制备特异性免疫血清，并对其效价及与KSHV 结合的特异性进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 细胞 KSHV 潜伏感染的BCBL-1细胞（南京医科大学卢春教授馈赠）。

1.2 动物 健康日本大耳白兔，雌性，体质量2.0～2.5kg，由右江民族医学院实验动物中心提供（批号：LX1304-A3）。

1.3 试剂与仪器 ORF65蛋白抗原肽［由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成］序列：ASDILTTLSSTTETAAPAVADARKPPSGKKK。细胞培养基RPMI-1640 为Bio Whittaker Cambrex Company产品，胎牛血清为Gibco 公司产品，山羊抗兔IgG（H＋L）-HRP、IgG（H＋L）-Alexa fluor 488、发光蛋白购自Cell Signaling Technology，完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂、OPD 底物、HRP-DAB底物显色试剂盒购于天根试剂公司，细胞免疫染色固定液、抗荧光淬灭封片液、Western细胞裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒为碧云天产品，预染蛋白分子量标准为Ferments公司产品，其他试剂均为国产分析纯产品。倒置相差显微镜（Leccia Microsystems CMS GmbH），酶联免疫检测仪（Berthold LB941），电热恒温水浴箱WH.W21.CU600（上海医疗器械七厂），激光共聚焦显微镜（FV-500奥林巴斯），ChemidocXRS型凝胶成像系统为美国Bio-Rad产品。

1.4 方法

1.4.1 家兔多克隆抗体的制备 选择4只纯种健康日本大耳白家兔，实验前采集家兔血清，作为阴性对照，分别用合成的ORF65蛋白抗原肽进行0、2、4、6周免疫程序皮内、皮下多点注射免疫。初次免疫抗原肽与完全弗氏佐剂等量混合，再次免疫抗原肽与不完全弗氏佐剂等量混合、充分乳化，免疫剂量为每只2mg。同时，于第4次免疫后1周，取心脏血。收集的血液于4 ℃下静置过夜，4 ℃下3 000r／min离心5min，取血清分装，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 家兔血清中抗ORF65抗体的ELISA 检测 用方阵滴定法确定包被抗原和血清的最适工作浓度，将包被抗原（ORF65）用pH9.6 的碳酸盐 缓 冲液稀释 为1.25、2.5、5.0、10.0μg／mL的溶液，取免疫血清及阴性血清各1 份，作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800稀释，ELISA 间接法检测血清抗体效价［7］。测定450 nm 处抗体稀释度均值（A 值），将450nm 处A 值为1.0左右的抗原包被浓度和血清稀释度确定为抗原肽的最适包被浓度和血清最佳稀释度［8］。

1.4.3 家兔免疫血清中抗ORF65抗体的间接免疫荧光检测 调整BCBL-1细胞浓度至1×106个／mL，用无血清培养基同步化24h后，加含20ng／mL佛波酯（TPA）的完全培养基培养48h。收集细胞，调整细胞浓度至2×106个／mL，离心涂片，用免疫染色固定液固定。0.1% PBS-T 洗涤3 次；用5%的BSA 37 ℃封闭30min，洗涤3次；分别加家兔ORF65免疫血清、免疫前兔血清，37 ℃孵育30 min，洗涤3 次；加山羊抗兔IgG（H＋L）-Alexa fluor 488，洗涤3次；PI染料染色5min，洗涤3次；用抗荧光淬灭封片液封片，镜检。

1.4.4 家兔免疫血清中抗ORF65抗体的Western blot检测 用20ng／mL TPA 诱导BCBL-1细胞48h，使细胞中KSHV活化，同时以未加TPA 刺激的BCBL-1细胞为对照。收集各组BCBL-1细胞蛋白加入RIPA（强级）裂解液，4 ℃下16 000 r／min离心5min。取上清液，电泳考马斯亮蓝染色确定上样量，分装，-80 ℃保存。进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白。转膜后，室温下用5%脱脂奶粉封闭1h，1×TBST 缓冲液漂洗3次；分别加免疫血清及β-Actin一抗，4 ℃下孵育过夜，洗膜3次；加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗孵育1h，洗膜3次；加化学发光试剂，于凝胶成像仪（chemidoc XRS，Bio-Rad，USA）中成像。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，两样本均数间采用t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 抗原和免疫血清的最适工作浓度 根据ELISA 方阵滴定法检测的要求，选择A 值在1.0左右时的抗原抗体浓度为最佳工作浓度，结果见表1、2。在接近A450＝1的组合中，得出最佳的工作浓度：抗原包被浓度为2.5 mg／L、抗体浓度为1∶6 400的组合。从抗原抗体最佳工作浓度的间接ELISA 法结果显示，在抗体浓度为1∶12 800，抗ORF65免疫血清抗血清A 值为（0.656±0.024），阴性血清A 值为（0.075±0.023），差异有统计学意义（P＜0.01），说明血效价达1∶12 800以上，已成功制备ORF65的多克隆抗体。

表1 抗ORF65免疫血清最适工作浓度方阵滴定（±s）

表1 抗ORF65免疫血清最适工作浓度方阵滴定（±s）

＊：P＜0.01，与阴性对照组比较。

ORF65（μg／mL）A值阴性对照1∶100 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1.25 1.233±0.036＊ 0.960±0.056＊ 0.888±0.025＊ 0.885±0.034＊0.293±0.031 2.5 1.376±0.023＊ 1.335±0.045＊ 1.282±0.041＊ 1.231±0.021＊ 0.282±0.021 5.0 1.223±0.033＊ 1.138±0.032＊ 0.933±0.047＊ 0.823±0.044＊ 0.369±0.038 10.0 0.908±0.039＊ 0.884±0.027＊ 0.812±0.033＊ 0.739±0.025＊0.291±0.046

表2 抗ORF65免疫血清最适工作浓度方阵滴定（±s）

表2 抗ORF65免疫血清最适工作浓度方阵滴定（±s）

＊：P＜0.05，△：P＜0.01，与阴性对照组比较。

ORF65（μg／mL）A值阴性对照1∶100 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1.25 0.804±0.038△ 0.633±0.023△ 0.445±0.020＊0.364±0.019 0.293±0.031 2.5 1.182±0.042△ 1.085±0.028△ 0.998±0.033△ 0.656±0.024△ 0.282±0.021 5.0 0.761±0.025△ 0.604±0.027△ 0.318±0.026 0.218±0.029 0.369±0.038 10.0 0.609±0.024△ 0.325±0.033 0.267±0.035 0.184±0.039 0.291±0.046

2.2 免疫荧光法检测ORF65蛋白表达及定位 阴性对照组显示微弱的绿色荧光，而实验组则显示较强的绿色荧光，且绿色荧光较多地集中在细胞质上，这说明ORF65 蛋白表达于BCBL-1细胞，并且表达于细胞质上，见图1。

图1 间接免疫荧光检测免疫血清对BCBL-1细胞中ORF65蛋白的免疫反应性（×400）

2.3 蛋白质免疫印迹法检测ORF65 蛋白表达 TPA 诱导BCBL-1细胞组及未加TPA 刺激的BCBL-1细胞对照组在21 kD 处均有特异性蛋白条带，其大小与ORF65蛋白大小相符，且TPA 诱导BCBL-1细胞组蛋白表达量明显高于未加TPA刺激的BCBL-1细胞对照组组，见图2。

图2 抗ORF65抗体特异性的Western blot鉴定

3 讨 论

KSHV 是卡波氏肉瘤发生的必需因素，跟未发生KS 的KSHV 感染者比较，KS 患者体内KSHV 的病毒载量含量较高，体内含活化病毒的细胞数量与组织发生恶化及病毒感染的进程有相应关系；而且在疾病的发展进程中病毒载量也随之提高［9-10］。KSHV 处于潜伏感染状态下的被重激活并裂解复制，此时可检测到多种病毒裂解复制产物，复制相关基因ORF59、包装相关基因ORF29、主要衣壳蛋白ORF26、包膜糖蛋白K8.1、小衣壳蛋白ORF65蛋白等，同时，KSHV 包装产生新的感染性病毒颗粒［11-15］。其中，ORF65蛋白是在子代病毒的装配中有重要作用，ORF65蛋白在细胞内主要发挥转运其他衣壳蛋白的功能，一旦ORF65蛋白缺失，病毒会发生衣壳缺失。因此，ORF65蛋白可作为检测KSHV 感染的一个重要的免疫学指标，也可以作为一个新的抗病毒靶点。

抗原抗体反应具有比例性，如果抗原抗体的浓度和比例适合则形成的复合物体体积大、数量多。如包被抗原浓度过高，由于蛋白质与酶标板的聚苯乙烯分子间的相互作用，蛋白质容易吸附于酶标板表面，可能产生前带现象而降低敏感性。如果包被液中的抗原浓度过低，固相载体（酶标板）表面不能被完全覆盖，酶标板孔表面容易非特异性吸附相继加入的一抗血清标本和二抗中的蛋白质，产生非特异性显色而影响检测结果，因此，在ELISA 方阵滴定法中接近A450＝1的组合中，得出最佳的抗原抗体工作浓度［7］。另外，在抗ORF65免疫血清浓度为1：12 800，抗血清A 值为0.656±0.024，阴性清A 值为0.075±0.023，差异有统计学意义（P＜0.01）。在进一步的免疫荧光检测实验中，用免疫血清可以检测到TPA 诱导活化的KSHV 感染的BCBL-1细胞显示较强的绿色荧光；用Western blot则可以检测到TPA 刺激与未刺激的BCBL-1 细胞中，TPA 刺激的BCBL-1细胞中病毒衣壳蛋白ORF65的表达量较高，该抗血清具有特异性。因此，推断本研究获得了高效价的抗ORF65家兔免疫血清。

本研究成功制备KSHV ORF65多克隆抗体，该结果为进一步制备ORF65单克隆抗体奠定了基础。基于ORF65蛋白在KSHV 复制中的重要作用，成功制备该抗体也为进一步研究临床KSHV 感染检测方法和探索抗病毒新靶点的研究奠定基础。

［1］ Chang Y，Cesarman E，Pessin M，et al.Identification of herpesvirus like DNA sequences in AIDS-associated K aposics sarcoma［J］.Science，1994，266（5192）：1865-1869.

［2］ Katano H，Sata T.Human herpesvirus 8virology，epidemiology and related diseases［J］.Jpn J Infect Dis，2000，53（4）：137-155.

［3］ Dilnur P，Katano H，Wang ZH，et al.Classic type of kaposi′s sarcoma and human herpesvirus 8infection in Xinjiang，China［J］.Pathol Int，2001，51（11）：845-852.

［4］ 马春雷，普雄明，吴卫东.新疆Kaposi肉瘤患者感染的人类疱疹病毒8型ORF75 基因多态性研究［J］.实用皮肤病学杂志，2009，26（2）：68-71.

［5］ Fu B，Li BL，Wang LD.Immunogenicity analysis of prokaryotic expression products of Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus ORF65［J］.Virologica Sincia，2008，23（3）：196-202.

［6］ 王娜，冷弘，燕备战，等.人类疱疹病毒8抗原融合的构建及初步应用［J］.重庆医学，2013，42（23）：2703-2705.

［7］ 杨婷婷，孙秀兰，邵景东，等.百草枯人工抗原的合成及抗体的制备［J］.细胞与分子免疫学杂志，2008，24（9）：924-927.

［8］ 杜瑞雪，范仲学，郭笃发.PCB77人工抗原的合成及多克隆抗体的制备［J］.细胞与分子免疫学杂志，2010，26（2）：149-151.

［9］ Ballestas ME，Chatis PA，Kaye KM.Efficient persistence of extrachromosomal KSHV DNA mediated by latencyassociated nuclear antigen［J］.Science，1999，284（5414）：641-644.

［10］ Decker LL，Shankar P，Khan G，et al.The kaposi sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）is present as an intact latent genome in KS tissue but replicates in the peripheral blood mononuclear cells of KS patients［J］.J Exp Med，1996，184（1）：283-288.

［11］ Sun R，Lin SF，Gradoville L，et al.A viral gene that activates lytic cycle expression of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（18）：10866-10871.

［12］ Sarid R，Flore O，Bohenzky RA，et al.Transcription mapping of the Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus（human herpesvirus 8）genome in a body cavity-based lymphoma cell line（BC-1）［J］.J Virol，1998，72（2）：1005-1012.

［13］ 南玉龙，谭晓华，杨磊.KSHV 潜伏和裂解感染机制的研究进展［J］.中国医学创新，2012，9（3）：151-153.

［14］ Lan K，Kuppers DA，Verma SC，et al.Induction of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen by the lytic transactivator RTA：a novel mechanism for establishment of latency［J］.J Virol，2005，79（12）：7453-7465.

［15］ 程伟，郝婷婷，王子盾，等.HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列的初寻［J］.南京医科大学学报：自然科学版，2011，31（5）：595-600.