广东省惠州地区基于医院水平的地中海贫血基因突变谱分析

钟泽艳 陈剑虹 贺海林 官志扬 徐志邦 钟艳娟 闫 梅 黄紫娟

广东省惠州市第一妇幼保健院产前诊断中心（516007）

地中海贫血（简称地贫）是一种单基因遗传性溶血性贫血病，全球有2%的人口为地贫携带者，我国南方高发地区人群携带率为1%～24%［1－2］。临床上以α和β地贫为最常见，研究表明广东省α和β地贫的发生率分别高达8.53%和2.54%［3］。在最新的广东省大规模人群地贫携带率的基线调查中，进一步发现广东省21个地级市的平均地贫基因携带率高达16.83%［4］。根据临床表征，α地贫可分为静止型、轻型、中间型和重型；β地贫可分为轻型、中间型和重型。目前，此病症仍然没有理想有效的治疗方法，因此做好预防和监控对控制和降低地贫的发病率非常重要。同时，惠州市是客家人的重要聚居地和集散地之一，最近的研究发现客家人的地贫基因携带率高［5］。因此，本研究对2014年4～9月在本院就诊的患者，进行地贫的筛查和基因诊断，以期获得惠州地区地贫基因携带率、基因型分布规律，为降低出生缺陷积累资料。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2014年4～9月，每个月电脑系统随机抽取我院的200例门诊患者和住院患者，共抽取2000例，患者的性别和年龄无限制。根据知情同意的原则，获取外周静脉血样本2ml。先血液学筛查地贫阳性样本，对其中540例愿意进一步检查的患者进行血红蛋白电泳分析，进一步采用多重PCR和反向点杂交（RDB）技术对血红蛋白结果异常样本进行地贫基因诊断，产前诊断中心对可能会分娩中重型地贫患儿的孕妇行羊膜腔穿刺术。采集胎儿羊水样本两管，一管直接法检测（培养前），另一管按照本中心建立的常规方法进行细胞培养后检测。

1.2 研究方法

1.2.1 血液学筛查 采用全自动血细胞分析仪检测红细胞平均容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）等。初筛血液学阳性标准为：MCV＜82.0fl或（和）MCH＜27.0pg。抽取血液学筛查阳性样本540例采用全自动血红蛋白电泳仪检测血红蛋白A（HbA）、血红蛋白 A2（HbA2）、HbF和异常血红蛋白条带。血红蛋白电泳，分别以 HbA2＜2.5%或（和）出现异常血红蛋白带（HbH，Hb Bart＇s）判定为α地贫表型阳性，HbA2＞3.5%判定为β地贫表型阳性［6］。

1.2.2 基因型分析 对其中电泳分析异常的样本使用广东省潮州凯普生物科技股份有限公司生产的试剂盒［5，7］进行基因分析，同时检测中国人常见的3种α缺失型地贫（--SEA／、-α4.2／、-α3.7／），3种α非缺失型地贫（αWSα／、αCSα／、αQSα／），16种β地贫［（CD41－42（－TTCT）、CD17（A－T）、CD43（G－T）、CD71－72（＋A）、IVS－I－I（G－T，G－A）、IVS－1－5（G－C）、IVS－II－654（C－T）、－28（A－G）、－29（A－G）、Cap（－AAAC）、Int（TG）、CD14－15（＋G）、CD27－28（＋C）、βE（G－A）、CD31（－C））］。按照操作说明书进行操作和结果判断。未有正常对照点的突变点或血液学筛查结果阳性而基因型在检测范围内的正常样本，进一步进行测序检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计学分析软件，分析受检人群地贫基因携带率和基因型分布规律。

2 结果

2.1 血液学结果

根据血液学初筛阳性样本的纳入标准，在随机抽取的2000例外周血样本中，检出表型阳性样本912例，阳性率为45.60%。在所抽540例血红蛋白电泳分析结果中，检出血红蛋白结果异常425例，阳性率为78.70%。其中，判定为α地贫表型阳性284例（66.82%）；判定为β地贫表型阳性141例（33.18%）。

2.2 地贫基因的携带率、基因型及分布规律

425例血红蛋白结果异常样本经基因检测，结果显示地贫基因携带者360例，基因阳性率为84.71%。推算本地区基于医院的地贫基因携带率为30.40%［（912×360／540）／2000］。共检出35种基因型，包括α地贫226例，占62.78%，主要基因型为--SEA／αα、-α3.7／αα、-α4.2／αα；β地 贫 112 例，占31.11%，主要基因型为CD41－42／N、IVS－II－654／N、－28／N；α地贫合并β地贫的复合型地贫22例，占6.11%，主要基因型为--SEA／αα合并IVS－II－654／N、--SEA／αα合并 CD41－42／N、αWSα／αα合并 CD41－42／N。具体基因型及其构成比详见表1。在所有样本中，检出中间型地贫12例，两种罕见型β地贫各1例，分别为CD113／N（T－A，Hb New York）和SEA－HPFH／N，这两例样本在血红蛋白电泳分析中分别检出39.19%HbK和19.92%HbF，详见图1、图2。

表1 360例地贫基因携带者基因突变类型及分布情况

图1 罕见型β地贫CD113／N测序图

图2 缺失型β地贫SEA－HPFH／N电泳图

2.2 夫妻地贫基因携带率及产前诊断

912例筛查阳性样本中包括205对夫妻（年龄18～49岁），均进行了血红蛋白电泳分析，同时经基因检测，所有夫妻中地贫基因携带者有189例。共检出21种基因型，α地贫120例，占63.49%，主要基因型为--SEA／αα、-α3.7／αα、-α4.2／αα，占95.83%；β地贫60例，占31.75%，主要基因型为 CD41－42／N、IVS－II－654／N、－28／N，占90%；α地贫合并β地贫的复合型地贫9例，占4.76%，主要基因型为--SEA／αα合并CD41－42／N、-α3.7／αα合并IVS－II－654／N、αWSα／αα合并CD41－42／N，占44.44%。其中，携带同型地贫基因夫妻44对，占21.46%。根据基因结果判断可能会分娩中重型地贫患儿的夫妻共36对，经行羊膜腔穿刺术检查，发现24例胎儿为地贫携带者，检出率为66.67%；重型地贫胎儿7例，占29.17%。具体基因型详见表2。胎儿引产后留取脐带血，经地贫基因诊断与产前诊断结果一致，且重型α地贫胎儿进行B超检测均存在水肿和心胸比例增大。

表2 36例羊水基因诊断结果

3 讨论

地贫主要是由于珠蛋白基因的缺失或突变使珠蛋白基因的表达受到抑制，引起相应的珠蛋白链合成减少甚至完全不能合成，导致α与非α肽链比例失衡所引起的遗传性溶血性贫血。随着政府和社会对地贫防控的重视，通过地贫防控知识的宣教，人们的认识水平得到了很大程度提高。惠州市地处地贫高发区的广东省中南部，从地域和人群上推断存在地贫高携带率的可能。

本研究以本院就诊的患者为研究对象，2000例外周血样本中，血液学筛查阳性率为45.60%。540例血红蛋白电泳分析结果异常425例，推测本地区基于医院患者的血红蛋白电泳阳性率为35.89%。其中，判定为α地贫者占66.82%，β地贫者占33.18%，两者比例约为2∶1。经基因检测，检出α地贫、β地贫和复合型地贫的基因携带者共360例，血红蛋白电泳分析结果阳性率与基因型检出率的一致性为84.71%。综合分析，惠州地区基于医院患者的地贫基因携带率约为30.40%，也再次验证α地贫比β地贫和复合型地贫的基因携带率高。与以往研究报道相比较，该地区地贫基因携带率明显高于广东省的许多其他地区［3－5］和中国南方的其他省份，包括广州（6.20%）［8］、深圳（6.49%）［9］、梅州（12.24%）［5］、江西（16.02%）［10］、福建（4.41%）［11］、广西（24.51%）［12］，且仅低于海南（53.45%）［13］。虽然本研究基于医院水平，研究人群存在一定的偏倚，但是该结果仍然可反映出惠州地区具有很高的地贫基因携带率，属于地贫高发区。截至2013年底，惠州市常住人口为470万人，由此推测该地区地贫的携带者约为143万人，加强该地区地贫防控任重而道远。

本研究中，共检出35种基因型，其中α地贫基因型 10 种，以--SEA／αα、-α3.7／αα、-α4.2／αα 为 主，占92.04%。从临床分型来看，静止型、轻型和中间型构成比分别为80.97%、13.72%和5.31%，可见轻型在临床所占比例最多，这与轻型中的基因型以东南亚型为主有关。β地贫基因型检出12种，以CD41－42／N、IVS－II－654／N、－28／N 为主，占83.93%，并且包含了两种罕见基因型CD113／N（Hb New York）和SEA－HPFH／N。罕见型地贫的检出说明进行血液学筛查和血红蛋白电泳分析具有很重要的提示意义，有助于发现罕见型地贫的存在，降低漏诊率。进一步证实，HbF是判定β地贫的重要依据之一，但由于影响的因素较多，单独HbF增高不能判定β地贫，只能提示可能为β地贫。复合型地贫基因型检出13种，以--SEA／αα合并IVS－II－654／N、--SEA／αα合并CD41－42／N、αWSα／αα合并 CD41－42／N 为主，占45.45%。由统计数据可以看到惠州地区人群中无论是α地贫还是β地贫，抑或复合型地贫的主要基因型分布情况与其他报道［3－13］相同。

本研究中，共有205对夫妻进行了地贫筛查和基因诊断。经基因检测，检出44对为同型地贫基因携带者，根据结果判定36对夫妻需进行产前诊断。在遵循产前诊断知情同意的原则下，均完成了高风险胎儿羊水的产前诊断。结果显示24例为地贫携带者，包括7例重型、2例中间型、9例轻型、静止型和复合型各3例。根据基因诊断结果，对于7例重型地贫胎儿遗传咨询医生建议终止妊娠，其他基因型的胎儿则解释清楚地贫的遗传特征以及携带者可能出现的临床表征，强调若下次妊娠仍需进行遗传咨询和产前诊断［14］。本研究中，6个月时间内阻止了7例重型地贫患儿的出生，证明通过对高危者进行产前基因诊断，可有效减少重型地贫患儿的出生，减少出生缺陷。

综上，惠州地区人群的地贫携带率很高，基因型分布特征与其他地区相似，为地贫防控提供了科学依据。鉴于地贫目前尚无有效的治疗方法，而重型患儿的出生会给家庭和社会带来巨大的经济和精神负担，通过产前筛查和基因诊断避免重型地贫患儿的出生及不良妊娠结局的发生是最根本的措施。因此，加强惠州地区的地贫筛查和基因诊断，扩展优生优育的服务面，进行地贫的遗传咨询与产前诊断具有重要意义。

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