褪黑素对创伤性脑损伤大鼠ERK-MAPK信号传导机制的影响

刘宝华　李海峰　胡克邦　刘海波(吉林大学第一医院二部，吉林　长春　130031)

褪黑素对创伤性脑损伤大鼠ERK-MAPK信号传导机制的影响

刘宝华李海峰胡克邦刘海波
(吉林大学第一医院二部，吉林长春130031)

〔摘要〕目的探讨褪黑素(MT)对创伤性脑损伤(TBI)急性期ERK-丝裂原活化蛋白酶(ERK-MAPK)信号通路的影响。方法制作大鼠创伤性脑损伤模型，打击损伤前30 min自尾静脉注射MT。细胞凋亡原位检测(TUNEL)荧光法检测细胞凋亡，Western印迹法检测损伤脑皮质pERK表达水平。结果TUNEL荧光法检测显示TBI+MT组损伤灶周围皮层TUNEL阳性细胞少于TBI组，凋亡指数降低(P＜0.05)。Western印迹法检测脑损伤后各个时间点pERK表达，在损伤后1 h起迅速升高，3 d为表达高峰，其后逐渐下降，但直到损伤后5 d仍未恢复至基础水平。TBI+MT组pERK水平较TBI组明显降低(P＜0.01)，而且MT 20 mg/kg组的pERK1/2水平低于10 mg/kg组(P＜0.05)。结论创伤性脑损伤诱导了强烈的ERKMAPK信号通路激活，MT能够剂量依赖性抑制ERK1/2-MAPK信号通路激活，并抑制急性期神经细胞凋亡。

〔关键词〕创伤性脑损伤; MAPK;信号传导

第一作者:刘宝华(1977-)，男，博士，主治医师，主要从事急重症医学的研究。

交通事故、意外伤害所致的创伤性脑损伤(TBI)的发生率逐年升高，主要的病理生理机制是缺血性脑损伤和继发的迟发性损伤，其死亡率和致残率高，然而临床安全和有效的干预措施仍有待于进一步的研究。褪黑素(MT)是普遍存在于生物体的一种吲哚胺类激素、进化保留因子，在体内引起多种生物效应，包括调节生物节律、神经内分泌-免疫系统等重要作用〔1〕。近年来研究发现MT具有很强的自由基清除作用及抗氧化作用，本实验观察MT对TBI大鼠丝裂原活化蛋白酶(MAPK)信号传导机制的影响及变化，旨在探讨MT的脑保护作用机制。

1　材料与方法

1.1试剂MT: Alexis公司产品，使用前先溶于无水乙醇，继以生理盐水稀释。细胞凋亡原位检测(TUNEL)试剂盒为瑞士Roche公司产品，兔抗phospho-ERK1/2抗体(1∶800，Cell Signaling，美国)、兔抗ERK1/2抗体(1∶800，Cell Signaling，美国)。

1.2大鼠TBI模型的建立选用成年健康SD大鼠125只，每只约250～300 g，雌雄兼用，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。自然光照周期饲养，术前12 h禁食，自由饮水。SD大鼠称重后经2％戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，俯卧固定于脑立体定位仪上。矢状中线切开头皮后分离骨膜，暴露前囟、冠状缝和矢状缝及顶骨。以前囟后310 mm，向右旁开矢状缝310 mm为中心作一直径约为4～5 mm颅骨钻孔。保持硬脑膜不受损伤。采用Feeney法制作大鼠中度脑损伤模型，落体致伤的冲击力为40 g×25 cm。将自由落体装置底座置于右顶骨窗部的硬脑膜表面，以40 g重物自25 cm高沿套管下落打击致伤，造成右顶局限性损伤。

1.3动物分组125只大鼠随机分为5组，每组25只:①假手术(Sham)组:手术操作同其他组，但仅作头皮切口，开颅骨窗不致脑损伤;②TBI组:于损伤前30 min静脉注射等体积生理盐水;③TBI + MT 5 mg/kg (MT5)组;④TBI + MT 10 mg/kg (MT10)组;⑤TBI+MT 20 mg/kg(MT20)组。③～⑤组于外伤前30 min静脉注射MT 1次。TBI组和TBI+MT组又按取材时间的不同分为伤后1、6 h、1、3、5 d共5个分析时相点，每个时相点5只。

1.4TUNEL荧光法检测细胞凋亡取经TBI区域皮质，新鲜冰冻切片制备连续冠状切片(厚度5 mm)，按德国BM公司TUNEL试剂盒说明书操作，进行切片的TUNEL荧光染色。光镜下监测染色。每个切片观察受伤灶中心皮质、皮层下白质、海马、齿状回及对侧相应部位脑组织，细胞核着绿色荧光(TUNEL阳性)和蓝色荧光(DAPI阳性)者为阳性细胞，即凋亡细胞。荧光显微镜下(10目镜×20物镜)每张切片随机选取3个无重叠视野，采用Image-ProPlus6.0图像分析软件分别计数DAPI染色阳性细胞和TUNEL染色阳性细胞数并计算神经细胞凋亡指数(AI) (％)，即凋亡细胞占视野总细胞数的百分比。

1.5Western印迹检测TBI脑组织pERK1/2表达在各个相应时间点，实验大鼠以10％水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，快速断头取脑，冠状切取顶叶皮层约100 mg，迅速剪碎，加入1 ml细胞裂解液，冰浴中匀浆，4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清液，Bradford法测定蛋白浓度。加入等体积2×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，煮沸10 min，10 000 r/min离心5 min。取样本30 μg进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，丽春红染色观察转移效果，根据标准分子量蛋白确定待测蛋白的条带位置。含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(PBS)液封闭2 h，按0.5 μg/ml浓度加入兔抗pERK1/2多克隆抗体，4℃孵育过夜，加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG(1∶2 000)，室温摇育1 h，洗涤后用增强化学发光试剂暗室内胶片曝光。用Gelwork4.0图像分析系统测定目的条带的吸光度值。以β-tublin(47 kD)为内参照，根据目的条带与β-tublin条带吸光度的比值表示待测蛋白含量。

1.6统计学方法采用SPSS18.0统计学分析软件对各组数据的组间比较进行t检验。

2　结果

2.1TUNEL荧光法检测MT对TBI后细胞凋亡影响情况TBI后1 h～5 d细胞凋亡检测显示，对照组(Sham组)和损伤组(TBI组)对侧脑组织未见或仅有极少量的凋亡细胞。坏死细胞(Ⅰ型细胞)主要集中在伤灶中心皮质，片状分布;凋亡细胞(Ⅱ型细胞)呈散在分布，相对集中于伤灶与正常组织交界的皮层、皮层下白质、海马和齿状回。伤后1 h伤侧脑组织即出现凋亡细胞，AI值与对照组相比差异显著(P＜0.05)，并随时间延长数量逐渐增多，其峰值出现在1 d，随后缓慢下降，但5 d时仍高于正常水平。TBI组较Sham组AI显著提高(P＜0.01)，而TBI +MT组较TBI组损伤灶周围皮质TUNEL阳性细胞少于TBI组，AI显著降低(P＜0.05)，其中TBI+MT20组降低程度最明显(P＜0.01)。见图1。

图1　TUNEL检测MT对TBI后细胞凋亡的影响

2.2Western印迹检测MT对TBI各组pERK1/2在脑组织内表达的影响pERK1/2表达水平在TBI后显著升高，并且在1 h和6 h持续高表达。TBI后MT治疗组pERK1/2水平较TBI组明显降低(P＜0.01)，MT 20 mg/kg组的pERK1/2水平低于10 mg/kg组(P＜0.05)。见图2。

图2　Western印迹检测MT对TBI各组PERK1/2在脑组织内表达的影响

3　讨论

TBI是一类严重的闭合性脑损伤，具有较高死亡率和致残率，其急性期治疗的重点在于减轻继发性脑损伤的程度。继发性脑损伤是一个复杂的病理过程，包括兴奋性氨基酸释放、炎性细胞因子产生、MAPK信号传导通路激活和细胞凋亡等。这些病理变化的产生和发展都需要经过细胞信号传导来完成，因此从细胞信号传导通路的关键环节来下调过度的细胞反应可能会为TBI的治疗提供新的思路。

近期研究发现，ERK-MAPK通路在局灶性颅脑损伤、脑缺血的继发病理改变中发挥了重要作用〔2〕。ERK1/2通路是将细胞外信号向细胞内传导的重要通路之一，各种细胞外信号先作用于细胞表面的受体，依次激活Ras、Raf-1及MEK，并进一步将ERK1/2磷酸化，pERK1/2从细胞质转移至细胞核，调节即刻反应基因和晚反应基因的表达，影响细胞的状态和功能。其中ERK1/2处于关键环节，可通过被磷酸化而活化，pERK1/2的表达可反映ERK1/2通路的活化水平。

ERK1/2磷酸化可以激活前凋亡转录因子，与其早期基因介导炎症和凋亡有关。MT是一种强效自由基清除剂，可以有效对抗氧离子和ONOO－〔3〕。电生理学研究证实其可以抑制大脑内N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的活性。通过氧化还原反应阻止nNOS活性和NO产生〔4〕。ERK1/2在TBI后被激活，其磷酸化过程收到细胞因子和自由基调控，可以缓解缺血损伤，而ERK1/2活性由外源性刺激产生神经保护作用。国外研究发现选择性突触外NMDA受体激活不激活体外ERK途径，但可以诱导维持ERK激活状态〔5〕。

本研究提示MT可以剂量依赖性抑制ERK1/2信号通路激活，并抑制急性期神经细胞凋亡，从而保护脑组织避免继发性损伤。MAPK信号转导通路在TBI的分子学机制中发挥了一定作用，MT可以有效抑制MAPK信号传导通路的激活，对TBI具有一定的保护作用。

4　参考文献

1Carbonell WS，Mandell JW.Transient neuronal but persistent astroglial activation of ERK/MAP kinase after focal brain injury in mice〔J〕．J Neurotrauma，2003; 20(4) : 327-36.

2 Grethe S，Porn-Ares MI.p38 MAPK regulates phosphorylation of Bad via PP2A-dependent suppression of the MEK1/2-ERK1/2 survival pathwayin TNF-alpha induced endothelial apoptosis〔J〕．Cell Signal，2006; 18 (4) : 531-40.

3 Koh PO.Melatonin attenuates the focal cerebral ischemic injury by inhibiting the dissociation of pBad〔J〕．J Pineal Res，2008; 44(1) : 101-6.

4 Lipton SA.Failures and successes of NMDA receptor antagonists: molecular basis for the use of open-channel blockers like memantine in the treatment of acute and chronic neurologic insults〔J〕．Neuro Rx，2004; 1(1) : 101-10.

5 Vaz AR，Silva SL，Barateiro A，et al.Pro-inflammatory cytokines intensify the activation of NO /NOS，JNK1/2 and caspase cascades in immature neurons exposed to elevated levels of unconjugated bilirubin〔J〕．Exp Neurol，2011; 229(2) : 381-90.

〔2014-12-11修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者:刘海波(1972-)，男，副主任医师，主要从事急重症医学的研究。

基金项目:吉林大学第一医院二部科研专项基金(2013年)

〔中图分类号〕R651.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4473-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.023