基于同源模建技术的抗肝癌单链抗体人源化抗体库设计

叶　刚　刘　丽　杨冬华　汤绍辉　周　旻丁世华　韦宏成　钟　健(暨南大学附属第一医院消化内科，广东　广州　5063)

基于同源模建技术的抗肝癌单链抗体人源化抗体库设计

叶刚刘丽1杨冬华汤绍辉周旻2丁世华韦宏成钟健
(暨南大学附属第一医院消化内科，广东广州510632)

〔摘要〕目的完成抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的人源化设计，为进一步构建人源化抗肝癌噬菌体单链抗体库奠定基础。方法通过IgBlast搜索基因数据库获取鼠源抗体序列模板，从蛋白质晶体结构数据库获得结构模板;在SGI图形工作站上，通过InsightlⅡ软件包进行抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构模建，分析抗体氨基酸序列和分子结构，确定影响抗原结合部位的框架区关键残基。结果成功模建抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构，确定AAW67378、BAB18257分别为单链抗体scFv DM的重链和轻链框架区最佳人源化模板，确定了人源化残基、回复突变的残基，将可能影响抗原结合位点结构的残基的鼠源和人源副本编入到人源化抗体库序列中。结论计算机辅助下的同源模建技术可为抗体人源化设计提供方案，为抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM同步实现人源化和优化提供可能性。

〔关键词〕同源模建;人源化;单链抗体;组合库;肝癌

1暨南大学附属第一医院校门诊部2广州市肿瘤医院化疗科

第一作者:叶刚(1969-)，女，博士，主治医师，主要从事肝病的诊治及教学研究。

目前，最常用的抗体人源化改造技术是抗体互补决定区(CDR)移植法〔1〕。如果仅仅将鼠源CDR移植到人源抗体框架区(FR)，亲本抗体的亲和力常下降，特异性很难保持。研究结果显示，将影响抗体互补决定区构象的重要残基进行突变，回复为鼠源残基可使亲本抗体的活性恢复〔2〕。需要解决的问题是如何确定这些重要残基。研究报道〔3〕，采用组合抗体库人源化优化法优化一个鼠源单抗的FR重构，恢复了抗体的活性。即选取同源性最高的序列作鼠可变区模板，分析三维结构，列出可能影响和不影响抗原抗体结合位点的重要残基，将后者人源化，对前者则将对应的鼠源和人源副本编入到一个序列中，构建人源化抗体库，筛选高亲和力的单链抗体。我们课题组成功构建鼠抗人肝癌噬菌体scFv库，并筛选获得1株特异抗肝癌的scFv(HscFv 4-16)，在GenBank的登录号为DQ640759，进而通过体外亲和力成熟获得高亲和力的一株抗肝癌scFv(scFv DM)〔4〕。本实验拟通过同步实现人源化和FR残基优化的组合抗体库人源化优化技术，对我们获得的鼠源scFv DM进行人源化改造，以获得免疫原性低，保持亲本亲和力和特异性的人源化抗肝癌scFv，为今后在肝癌早期诊断和治疗领域的发展提供新方法和手段。

1　材料和方法

1.1材料从本课题组获得scFv DM的基因序列，采用Ig-Blast，从EMBL、GenBank、DDBJ和Kabat Database等基因数据库搜索鼠源抗体模板序列，从蛋白质晶体结构数据库(PDB)获取结构模板坐标，使用InsightlI软件包(Accerly公司)进行抗体三维结构模建。

1.2方法

1.2.1鼠源抗体序列分析通过IgBlast搜索EMBL+Genbank+ DDBJ+Kabat Database数据库，确定scFv DM抗体重链和轻链的CDR和FR模板序列，再进行鼠源序列亚组分析，初步确定序列的罕见残基。

1.2.2鼠源单链抗体三维结构的模建通过InsightⅡ工作站进行抗体三维结构模建:从抗体结构数据库获取鼠源抗体同源蛋白结构，用HOMOLOGY软件包比对抗体结构，比较主链的碳原子Cα均方根位移(RMS)，进行结构叠合，分别确定RMS＜1Å和RMS＞1Å的区域为参考蛋白的结构保守区(SCR)和结构可变区(LOOP区) ;赋值结构保守区空间坐标;完成变异区模建和侧链安装;最后优化模建结构和合理化验证模建结构〔5〕。

1.2.3FR区人源化模板的选择通过IgBLAST，比对数据库中的人源抗体序列，确定同源性最高的5条人源抗体可变区模板序列，再评估胚系基因，同源性，CDR长度一致性，回复突变数量等因素，最终确定FR区模板。

1.2.4鼠源抗体FR关键残基的确定根据文献报道〔6〕，以下FR残基对抗原抗体结合部位的构象:①结合位点外周残基:通过InsightⅡ工作站，搜索模建的抗体三维结构每个CDR的5Å范围空间;②轻链/重链相互作用部位的保守残基:利用抗体三维结构，结合Chothia的定义确定轻链/重链相互作用部位残基;③正则结构关键残基;④游标区(Vernier区)的残基;⑤罕见残基。

1.2.5人源化抗体基因序列的设计把鼠源抗体CDR序列插入到已确定的人FR序列，比对FR序列，确定人、鼠间不同的残基，然后将不能判定对抗原结合构象是否重要的人源、鼠源氨基酸残基均列入人源化抗体基因序列中。

2　结果

2.1鼠源单链抗体三维结构的模建及结合位点周围残基的确定H1A6W、H1IQW和H1QAX被确定为重链的结构参考蛋白(三者的RMS为0.464Å)，L1AY1、L1BQL和L2IFF被确定为轻链的结构参考蛋白(三者的RMS为0.466Å) ;按照前述的同源模建步骤进行模建，获得scFv DM的三维结构，见图1，图2。通过Prostat合理化验证，模板1NQB的83％Φ和Ψ分布核心区域，模建三维结构的为81％，证明预测的结构合理可靠。鼠源单链抗体结合位点周围残基见图3。

图1　scFv DM的三维结构(飘带图)

2.2CDR的确定及正则结构关键残基的确定根据模建的抗体分子三维结构CDR的长度确定正则结构，继而判定对保持CDR环结构起重要作用的残基，见表1。

图2　scFv DM的三维结构(线形图)

图3　抗原结合位点周围残基

表1　CDR环的划分和正则结构关键残基(Kabat法编号)

2.3VL/VH相互作用面的堆积残基和Vernier区残基利用抗体三维结构，位于VL/VH相互作用部位的重要堆积残基参照Chothia的定义确定，VH 10个(35、37、39、45、47、91、93、95、101、103)，VL 10个(34、36、38、44、46、87、89、91、96、98) ; Vernier区的氨基酸残基构成CDR的支撑结构，确定为: VH 2 27-30 47-49 67 68 71 73 78 93-94 103; VL 2 4 35-36 46-49 64 66 68-69 71 98(以上残基均按Kabat法编号)。

2.4FR区人源化模板的选择通过IgBLAST搜索工具，将鼠源scFv的重链和轻链分别所有人源抗体氨基酸序列作比较，将VH和VL的5条同源性最高的模板做候选模板，比较与鼠FR的同源性及可能需回复突变的残基数，见表2。VL的候选模板中，2FEE同源性高达83.95％，但它不属于胚系基因，因此排除。ABA26082、BAB18257和AAC41992的同源性均为71.6％，但需回复突变的残基数目不同。VH的候选模板ABF83408和1JV5-B的同源性均为77.38％，但1JV5-B的多个FR长度与鼠抗体不同，而ABF83408的CDR3比鼠抗体的多一位，因此均不适于做VH的FR模板。最后确定同源性较高且需回复突变残基较少的BAB18257、AAW67378分别为VL和VH的FR区人源化模板。

表2　scFv DM的重链和轻链框架区候选模板比较

2.5组合库优化法人源化抗体序列的设计

2.5.1比对人、鼠FR的差异残基比对VL和VH人、鼠FR序列，确定分别有23个和20个残基不同，其中人源化残基: L10T，L11L，L13L，L21L，L42Q，L43A，L72T，L76S，L77S，L78L，L80P，L83F，L84A，L85V，L106I; H7V，H9S，H11A，H14K，H22V，H40A，H42GH75I，H83R，H85D，H87T;应该回复突变的残基: L49N，L60A，L70D，L71F，H48M，H69M，H71R，H91Y;难以判断对抗原结合作用的残基: L22S，L58I，H5Q，H67V，H70T，H73T，H82AS，见图4。

2.5.2编写抗体人源化序列将鼠源抗体CDR插入到已选择好的人FR，将不易确定回复突变影响的7个残基的鼠、人源副本都编写入鼠人组合抗体库中(以鼠/人表示) : MAQV(Q/ K )LVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYISTSYDIDWVRQAPGQGL-EWIGWIFPGEGSTEYNEKFKGR (V/A) TL (T/S) VD (T/K) SISTAYMEL (S/T) RLRSDDTAVYFCARGDYYRLYFDLWGQGTTVTVSS-GGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPA TLSLSPGERATL (S/T ) CSASSSTRYIYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNVAPG(I/V) PFRFSGSGSGTSYTLTISSLEPEDFAVYYCQERSGYPYTFGGGTKLE IKR。

图4　重链和轻链的框架区模板序列及关键残基比对

3　讨论

制备人源抗体或人源化抗体是克服鼠源抗体产生人抗鼠抗体(HAMA)反应的两种常用方法。但目前制备亲和力高、特异性强的人源抗体较为困难，所以人源化改造鼠源抗体仍然是我们获取治疗性抗体的重要方法。

本实验通过InsightⅡ软件包，对特异性抗肝癌scFvDM进行同源模建，获得抗体的三维结构，为人源化抗体序列设计的优化提供基础。

划定抗体的CDR和FR是设计人源化抗体序列的首要步骤。通用的CDR的划定法有: Kabat序列划分法和Chothia结构划分法。按Kabat划分法，CDRH2是H50-H65，而Chothia划分法确定的CDRH2是H52-56。Chothia划分法确定的CDR区较前一种方法的短，使得CDR移植后的抗体中的鼠源成分存留相应较少，可降低免疫反应。但正确划定CDR还是保持人源化抗体亲和力的重要一步。Kabat定义的CDRH2中只有H50～H58残基与抗原接触〔7〕。有研究〔8〕报道，因未将H59～H65部位残基划入CDRH2而移植到人源化抗体中，亲和力较亲本抗体降低了1 000多倍。因此，本实验中我们采用Kabat划分法，人源化抗体的CDRH2为H50～H65，以保持亲和力。对CDRH1的划分，采用Kabat法为H31～35B，在分析模建的抗体三维结构，H30是I，因而，我们将人源化抗体的CHDH1调整为H30～H35B，力求划分准确。

人FR模板的选择是抗体人源化的第二个关键步骤。FR不仅参与CDR的空间构象，还对抗体结合位点构象的形成有影响，有时还参与抗原的结合〔6〕。简单的CDR移植常常使抗体亲和力降低甚至丧失。共有序列、非胚系基因和胚系基因均可选择。共有序列是人造的序列，有不含特异反应性氨基酸残基的优势，但终究是人造的，故弃用。在5条同源性最高的候选模板中，2FEE同源性最高(83.95％)，但属于非胚系基因。非胚系基因可能带有未知的体细胞突变，而产生免疫原性，因此改选同属于一个胚系KappaⅢ亚组的AAW67378做模板。

确定FR的关键残基是人源化抗体的另一个重要步骤。因为构成抗体FR的残基对抗原结合、FR折叠(内部堆积)和稳定CDR构象等方面的重要性并不相同。按重要性大小可将构成抗体FR残基分为三类〔9〕:高风险性残基指直接参与抗原的结合、稳定FR折叠或CDR构象的残基。替换在这些位置的残基，会降低人源化抗体的活性。实验还证明，将FR区的关键残基回复突变对抗体亲和力的恢复有重要影响，甚至可使抗体的分泌表达量增加〔10〕。暴露于溶剂而对抗体结构和抗原结合影响少的残基属于低风险残基，将它们替换能降低免疫原性而几乎对抗体的亲和力无影响;而有选择地替换中度风险性残基，则有可能使人源化抗体的亲和力提升。

本文比较鼠源抗体重链FR区和模板序列，发现有20个不同残基。首先确定不可替换的高风险残基:与抗原接触的残基、正则结构关键残基，“游标区”的残基。结合三维结构看，PheH91 和LeuH69均属于抗原接触残基，可能影响CDR的构象，因此我们决定将它们划入回复突变残基。IleH48(Kabat编号)为“游标区”(vernier zone)残基，ValH71是正则结构残基，均需保留。

鼠源抗体轻链和模板的FR区比对，共有23个不同残基。TyrL71属于正则结构残基，确定回复突变为鼠源残基。SerL70，PheL60和TyrL49均为CDR外周5Å范围残基。TyrL49紧靠CDRL2，分析三维结构，它的芳香环侧链伸向抗原结合位点。许多人源化研究〔11，12〕均将确定为回复突变。H5，H67，H70，H73，H82a，L22和L58虽然都属于CDR外周5Å范围的残基，但人FR相对应残基的疏水性与它们相当，甚至更高，难以确定是否应该回复突变，因此，将鼠源和人源残基的核酸密码子作为简并密码，都编进人源化抗体序列中。

本研究成功模建抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构，选择BAB18257和AAW67378分别为单链抗体scFv DM的轻链(VL)和重链(VH)框架区(FR)最佳人源化模板，确定了回复突变残基、人源化残基和难以判断残基，完成人源化抗体序列的设计。拟进一步采用噬菌体展示技术，构建人源化组合抗体库，利用噬菌体抗体库强大的筛选功能，获取高亲和力的人源化抗肝癌单链抗体。

4　参考文献

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〔2015-01-17修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

通讯作者:钟健(1961-)，男，副主任医师，主要从事消化系统疾病的诊治及教学研究。

基金项目:广东省科技计划项目基金(No．2013B022000075) ;广东省中医药局建设中医药强省科研课题(20131152) ;广东省医学科研基金(A2011336) ;广东省科技计划基金项目(No．2006B19901014)

〔中图分类号〕R735.7

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4467-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.021