脑胶质瘤细胞MGMT甲基化状态与细胞对烷化剂耐药性的关系

李培栋　王新军　单　峤　吴跃辉　王　振(郑州大学第五附属医院神经外科，河南　郑州　450052)

脑胶质瘤细胞MGMT甲基化状态与细胞对烷化剂耐药性的关系

李培栋王新军单峤吴跃辉王振
(郑州大学第五附属医院神经外科，河南郑州450052)

〔摘要〕目的探讨脑胶质瘤细胞O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子甲基化状态与细胞对烷化剂药物(TMZ)耐药性的相关性。方法取处于对数生长期的人脑胶质瘤细胞系U87-MG、T98G和U251，利用MTT法检测不同浓度TMZ对上述三种胶质瘤细胞系的作用。提取细胞基因组DNA，用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测胶质瘤细胞中MGMT基因甲基化状态。结果与对照组(0.1％DMSO)相比，TMZ仅能抑制U87-MG细胞的活性(P＜0.05)，而不能抑制T98G和U251细胞的活性(P＞0.05) ;运用MS-PCR检测到U87-MG存在MGMT启动子甲基化，而T98G和U251均不存在MGMT启动子甲基化。结论U87-MG、T98G和U251人脑胶质瘤细胞系MGMT启动子甲基化状态与细胞对烷化剂的敏感性存在相关性。

〔关键词〕胶质瘤;替莫唑胺;耐药性; MGMT启动子甲基化

第一作者:李培栋(1971-)，男，副主任医师，主要从事脑血管病、脑肿瘤的外科治疗研究。

脑胶质瘤的治疗包括手术治疗、化疗和放疗等，术后化疗是治疗脑胶质瘤重要的辅助手段。替莫唑胺(TMZ)是一类新型烷化剂，是脑胶质瘤术后化疗的重要药物，对脑胶质瘤的作用可能与O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化相关〔1〕。然而，脑胶质瘤对TMZ的耐药现象很常见〔2，3〕，而且胶质瘤的标本不易得到，因此应用人源性脑胶质瘤细胞系研究耐药机制受到关注。本实验旨在应用U87-MG、T98G和U251人脑胶质瘤细胞系研究脑胶质瘤细胞MGMT基因甲基化状态与细胞对烷化剂耐药性之间的关系，为提高脑胶质瘤患者化疗效果提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验材料人脑胶质瘤细胞株U87-MG、T98G和U251 (ATCC公司)，DMEM、胎牛血清(FBS) (GIBCO公司)，二甲基亚砜(DMSO)、替莫唑胺(Sigma公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma公司)，基因组DNA提取试剂盒、DNA甲基化修饰试剂盒(美国ZMYO RESEARCH公司)，DNA聚合酶(日本Takara公司)。

1.2细胞培养冻存的胶质瘤细胞系U87-MG、T98G和U251从液氮罐中取出，迅速投入37℃水浴至融化，离心后小心弃上清，取配制好的含10％FBS的DMEM培养液轻轻吹打混匀，置于37℃5％CO2的培养箱中进行培养，待细胞达70％～80％汇合时用于实验。

1.3MTT法检测TMZ对胶质瘤细胞系的作用将TMZ溶于DMSO中配制成终浓度为10 mM，放置于－20℃保存，用时倍比稀释至所需浓度。取脑胶质瘤U87-MG、T98G和U251细胞，将细胞浓度为2×104/ml的悬液接种于96孔板中，每孔100 μl，放入细胞培养箱中培养24 h后弃去上清，分别加入0.4、4、40 μmol/L TMZ(0.4、4、40 μmol/L)作用48 h后加入20 μl的MTT，37℃孵育4 h后，弃上清，然后加入DMSO 150 μl，15 min后用酶标仪(Tacan，Switzerland)在570 nm处测定各孔吸光度。根据吸光度值计算细胞存活率。药物敏感性的判断标准为: 1× PPC浓度(4 μmol/L)的TMZ能抑制胶质瘤细胞活性为敏感，1×PPC浓度(4 μmol/L)的TMZ不能抑制胶质瘤细胞活性为耐药。

1.4细胞DNA的提取用DNA提取试剂盒对U87-MG、T98G 和U251细胞进行DNA提取，具体操作步骤按照试剂盒的说明书进行，提取后用紫外分光光度计进行DNA浓度的检测。

1.5MGMT基因扩增用DNA甲基化修饰试剂盒进行亚硫酸氢盐的修饰，步骤参照所用试剂盒的说明书。甲基化和未甲基化引物的设计参照文献〔3〕，引物序列MGMT甲基化上游: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC，下游: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG，81 bp; MGMT非甲基化上游: TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT，下游: AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA，93 bp。引物由日本Takara生物技术有限公司进行合成。

采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)方法，以修饰所得的基因组DNA作为标本，选用Taq DNA聚合酶对MGMT启动子序列进行扩增。扩增的循环参数: 95℃5 min; 95℃45 s，引物退火温度30 s，72℃60 s，共35个循环; 72℃延伸5 min。待反应结束后，对扩增产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴乙啶染色，在凝胶成像系统下进行结果观察。结果判定:出现非甲基化条带而且没有出现甲基化条带则判定为MGMT启动子非甲基化;出现甲基化条带时则判定为MGMT启动子甲基化状态。1.6统计学方法应用SPSS13.0软件行t检验。

2　结果

2.1TMZ对胶质瘤细胞系的活性影响与对照组(0.1％DMSO)相比，4 μmol/L的TMZ能降低U87-MG细胞存活率至89.7％(P＜0.05)，40 μmol/L的TMZ使细胞存活率降至67.3％ (P＜0.05)。对于T98G和U251细胞系，0.4、4 μmol/L和40 μmol/L的TMZ均不能抑制细胞的细胞活性(P＞0.05)。因此，在所检测的胶质瘤细胞系中，U87-MG对TMZ敏感，而T98G和U251细胞系对TMZ不敏感。见图1。

图1　TMZ对三种胶质瘤细胞的作用

2.2三种胶质瘤细胞中MGMT启动子甲基化状态检测U87-MG细胞出现甲基化条带(M)，表明U87-MG细胞存在MGMT启动子呈甲基化状态;而T98G和U251细胞出现非甲基化条带(U)，且没有出现甲基化条带(M)，表明T98G和U251细胞MGMT启动子为非甲基化状态。见图2。

图2　MGMT基因启动子的MS-PCR扩增

3　讨论

脑胶质瘤是最常见的恶性的原发性颅内肿瘤，化疗是脑胶质瘤综合治疗措施中重要组成部分。TMZ是一种咪唑四嗪类衍生物，为新型烷化剂，具有口服后吸收率高，脂溶性强，易透过血脑屏障，并且不良作用小等优势药理特性，已成为脑胶质瘤的一线化疗药物〔4〕。研究表明胶质瘤细胞对TMZ敏感性可能与MGMT的表达水平相关。MGMT是DNA修复酶中的一种，可以对烷化剂等药物造成的DNA损伤进行修复，进而使肿瘤细胞产生耐药，并且其蛋白表达受MGMT基因启动子甲基化状态调节。MGMT基因启动子甲基化导致MGMT蛋白表达降低，反之，MGMT基因启动子非甲基化导致MGMT蛋白表达增高。大量文献研究数据表明，肿瘤组织对烷化剂产生耐药性的主要原因是MGMT蛋白在脑胶质瘤组织中的表达〔5，6〕。一项临床随机对照试验〔7〕指出胶质瘤患者MGMT启动子甲基化与TMZ的治疗相关: MGMT启动子甲基化的患者受益于TMZ的治疗，而非甲基化的患者则没有显示出对TMZ的获益。

本研究证实U87-MG、T98G和U251人胶质瘤细胞系对TMZ的敏感性与其MGMT启动子甲基化状态相关，提示胶质瘤细胞系对烷化剂TMZ的敏感性与其MGMT启动子甲基化状态。这一研究结果与之前的研究结果一致〔7～9〕。

综上所述，本研究证实胶质瘤细胞MGMT启动子甲基化与胶质瘤对烷化剂耐药有密切关系，为临床化疗药物的选择提供了理论依据。

4　参考文献

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3 Lee S，Kim WH，Jung HY，et al.Aberrant CpG island methylation of multiple genes in intrahepatic cholangiocarcinoma〔J〕．Am J Pathol，2002; 161(3) : 1015-22.

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9 Ueda S，Mineta T，Nakahara Y，et al.Induction of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by dexamethasone in glioblastomas〔J〕．J Neurosurg，2004; 101(4) : 659-63.

〔2015-01-13修回〕

(编辑袁左鸣)

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4463-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.019