有效微生物活菌总数检测技术研究

肖玉娟 何少贵 林慧霞

有效微生物活菌总数检测技术研究

肖玉娟 何少贵 林慧霞

有效微生物，英文名Effective Microorganisms，常缩写为EM，是日本琉球大学比嘉照夫教授在20世纪80年代初期研究成功的一种由5科10属80种微生物复合而成的多功能微生态制剂[1]。EM菌可在使用处形成良好的微生态环境，在种植[2]、畜牧[3,4]、水产[5]、饲料[6]以及人体保健[7]等方面，尤其是环境修复方面有重要的应用[8～12]。

EM制剂中活菌总数是影响产品质量的主要因素，因此，对EM菌中活菌总数进行准确检测有重要的意义。目前国内外尚无针对EM制剂活菌总数的有效检测方法与标准，实际操作中多采用GB 4789.2系列《食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法。而EM制剂菌群组成复杂，各种微生物生长所需营养与环境条件及其生长速度差异较大，国标法在EM制剂活菌总数检测中的适用性有待考察。本文在GB 4789.2-2010的基础上设计和优化了EM菌活菌总数的平板计数法，并对其检测效果进行了实验研究。

材料与方法

1.材料

(1)EM菌：江西益生生物技术有限公司提供，其中液体样4个，编号1,2,3,4；粉剂样2个，编号5,6。糖蜜：江西益生生物技术有限公司提供。

(2)培养基[13]

平板计数琼脂 (g/L)：胰蛋白胨5；酵母浸膏2.5；葡萄糖1；琼脂15。

2.样品检测

方法同GB 4789.2-2010，其中为防止培养基干枯，每块平板加入培养基25-30ml，培养时间超过72h的平板以保鲜膜密封，防止水分过度蒸发。

3.检测效果的评价

4.影响因素的考察

以GB 4789.2-2010的计数培养基及培养条件为出发培养基与培养条件，即培养基为平板计数琼脂，初始pH值为7.0，培养温度为36℃，培养时间为48h。由于预实验中发现糖蜜的添加可显著提高检出的菌落数，因此，本论文对糖蜜的添加量及培养基初始pH值，培养温度与培养时间进行了考察。确定一项最优条件后，后续试验均按前面的优化值来进行。

结果与分析

1.培养基中糖蜜浓度的影响

糖蜜为EM菌发酵培养基中的主要成分，营养丰富，EM菌中的大部分菌株均可利用糖蜜生长繁殖，对国标法中的计数琼脂可起到良好的补充作用。但糖蜜颜色较深，添加量过大时培养基透光度低，易造成漏检，因此本实验选择了0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%这五个水平的糖蜜添加量(V/V)进行考察，检测结果如图1所示。

图1 糖蜜浓度对报告率的影响

从图1中可以看出，添加糖蜜至培养基中后，EM菌的报告率提高显著；且试验中可观察到大部分菌落均显著变大，易于观察。糖蜜浓度低于1.0%时，报告率随糖蜜浓度的升高而上升，大于1.0%时报告率基本保持稳定，平均值略有降低，原因可能是：①平板检测法本身存在一定的误差，实验组数为6时并不能完全消除其误差；②糖蜜浓度的升高使培养基颜色加深，部分较小的菌落被漏检。选择添加1.0%的糖蜜至平板计数琼脂中效果较优。

2.培养基初始pH值的影响

添加糖蜜后的计数培养基初始pH值约为5.0 (糖蜜浓度差异影响不显著)。由于EM菌中各菌株间的最适生长pH值可能存在差异，同时，pH值的调节可能对糖蜜中的营养成分造成影响，因此本实验中使用磷酸盐缓冲液[13]对培养基pH值进行调节，考察了培养基初始pH值为5.0,6.0,7.0,8.0时检出菌落数的差异，结果如图2所示。

图2 初始pH值对报告率的影响

图2结果显示，培养基初始pH值低于7.0时，平均检出率随pH值的升高而略有降低，pH值从7.0上升至8.0时，平均检出率显著下降。原因可能有：①EM菌中大部分菌株在pH值5.0～7.0的培养基中生长，pH值5.0为其较适生长值；②在实验中观察到随着pH值的上调，培养基颜色略有加深，这可能是糖蜜中部分营养物质随pH值上升而变性，不利于微生物生长。因此，实验中培养基的初始pH值为5.0最佳。

3.培养温度的影响

鉴于EM菌中各菌株的最适生长温度可能存在差异，本论文对培养温度为25℃,30℃，36℃，40℃时的菌落检出率和平均报告率进行分析，培养温度的影响如图3所示。

图3 培养温度对报告率的影响

从图3中可以看出，培养温度在25℃～36℃之间时，平均报告率随温度的升高而显著上升，温度升高至40℃时，平均报告率显著下降，表明培养温度对报告率影响较大，以36℃为宜。

4.培养时间的影响

EM菌中部分处于休眠状态和生长速度较慢的菌株在48h培养时间内不能形成肉眼可见的菌落，常导致漏检。实验对培养时间为48h，72h，96h下的菌落数进行了检测。不同培养时间的报告率如图4所示。

图4 培养时间对报告率的影响

从图4中可以看出，培养时间从48h延长至72h时，平均报告率得到有效提升(17.5%)，且大部分菌落直径显著变大，计数容易。培养时间延长至96h时，平均报告率仅提高1.7%，而培养时间过长会导致培养基水分过度蒸发，需要将平板密封，增加了实验操作并延长报告时间，因此，72h为较合适培养时间。

5.与国标法的效果比较

图5为同一样品相同稀释度下使用国标法与本研究计数法的检测平板结果图；其中左侧平板为GB 4789.2-2010计数平板，右侧为实验改良计数平板。

图5 检测效果对照

结果表明：在培养基糖蜜浓度为1.0%，初始pH值自然，培养温度为36℃，培养时间为72h的改良平板上，菌落较大，计数容易，菌落数多，EM菌检出率显著高于国标法。

结语

EM菌剂中菌种组成复杂，GB 4789.2-2010中的计数培养基组成和培养条件难以满足其中大部分微生物的营养和生长需求。添加糖蜜能够起到有效的营养补充作用，选择1%(V/V)糖蜜培养基，初始pH值自然，培养温度36℃，培养时间为72h能够有效地提高EM菌剂中的菌落检出率，该条件下检出的菌落数为GB 4789.2-2010方法检出菌落数的8.05～14.66倍，展示出显著的改进效果和适用性能。

（作者单位：厦门华厦学院）

[2]车豪杰,华龙洲,陶新颖等.EM益生菌在设施蔬菜生产中的应用效果[J].山东蔬菜,2007,4：32-33

[3]赵贵宝.EM技术在生态畜牧业中的应用研究 [J].广东奶业,2009,2：35-36

[4]朱建明,华仁林.EM菌剂在养猪生产上的应用[J].上海畜牧兽医通讯,1997,3：26-27

[5]方云东.EM菌在南美白对虾养殖中的应用试验[J].北京水产,2004,2：30-31

[6]黄玉德,张文建,皇甫万祥.EM菌液发酵鸡粪的方法及饲喂生猪的效果[J].兽药饲料添加剂,1997,2：11-12 [7]任雁,张惟广,叶舸.有效微生物群及其保健功能机制探讨[J].粮食与油脂,2005,9：12-15

[8]吴荣芳,陈克局,解清杰等.EM技术处理废水的研究进展[J].武汉科技学院学报,2006,19(7)：38-40

[9]唐德仁,付杰荣,邹水洋.EM技术在糖厂废水处理中的应用及评估[J].甘蔗糖业,2001,2：42-46

[10]曹海艳,韩树钢,张雁秋.EM菌强化SBR处理生活污水的试验研究[J].环境科学与管理,2006,31(8)：85-87

[11]熊小京,曹晓婷.EM菌在污水生物处理工艺中的应用[J].环境卫生工程,2007,15(3)：11-14

[12]鲁艳英,金亮,王谨等.EM菌组成鉴定及其消除垃圾渗滤液恶臭研究[J].环境科学与技术,2009,32(8)：62-63

[13]GB 4789.2-2010食品微生物学检验 菌落总数测定[S]

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