脂多糖通过TLR4-Src信号介导微囊胞吞血管内皮钙黏蛋白和增加血管通透性*

张 晔 张连阳 谭 浩 李 阳 孙士锦

脂多糖通过TLR4-Src信号介导微囊胞吞血管内皮钙黏蛋白和增加血管通透性*

张 晔 张连阳#谭 浩 李 阳 孙士锦

目的：探讨脂多糖(LPS)诱导微囊胞吞血管内皮钙黏蛋白(VE-Cad)的可能机制。方法：培养人血管内皮细胞株CRL-2922，当其生长至融合状态时分为正常对照组(不予再处理)、LPS处理组(采用10μg/ml LPS分别与CRL-2922再培养1h、2h、4h和6h)、LPS+抑制剂组包括Toll样受体4(TLR4)抑制剂CLI-095和Src抑制剂SU6566[在LPS培养细胞时分别加入CLI-095(5μg/ml)和SU6566(2μmol/L)再培养4h]。采用Western Blotting法检测各组Src蛋白表达、Cav1磷酸化和VE-Cad质膜蛋白表达，以及Cav1与VE-Cad共沉淀水平；采用培养小室半透膜培养细胞，并检测相关各组细胞荧光透过率，以反映血管通透性。结果：LPS处理不同时间组Src蛋白表达均较正常对照组升高(P<0.05)；与正常对照组比较，LPS处理4h组Cav1磷酸化增强(P<0.05)、VE-Cad质膜蛋白表达下调、Cav1与VE-Cad共沉淀水平升高(P<0.05)，单层细胞荧光透光率增加(P<0.05)；TLR4抑制剂和Src抑制剂可显著降低LPS增高的Src蛋白高表达和Cav1高度磷酸化(P<0.05)，上调VE-Cad质膜蛋白表达(P<0.05)，下调Cav1与VE-Cad共沉淀水平(P<0.05)，改善单层内皮细胞通透性(P<0.05)。结论：LPS可能通过TLR4-Src信号途径诱导微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

脂多糖；Toll样受体4；Src蛋白；微囊胞吞血管内皮钙黏蛋白；血管通透性

严重创伤、脓毒症患者存在血管通透性增高，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是脓毒症的重要启动因子，阐明LPS诱导血管通透性增高的发生机制有重要意义。本实验室前期研究(待发表)发现，细胞质膜微囊(Caveolae，简称微囊)介导血管内皮钙黏蛋白(Vascular Endothelial Cadherin，VE-Cad)胞吞是LPS致血管通透性增高的重要原因；同时发现，微囊胞吞VE-Cad过程中，微囊重要结构蛋白小窝蛋白(Caveolin-1，Cav1)磷酸化显著增高。但LPS磷酸化Cav1的信号途径目前尚不清楚。

研究表明，人肺微血管内皮细胞原癌基因c-Src活化可加强Cav1磷酸化和微囊胞吞白蛋白和霍乱毒素B亚基[1]，而LPS可活化Src[2]，且与Toll样受体4(Toll-like Receptor 4，TLR4)有关[3]。因此推测，LPS可能通过TLR4和Src途径磷酸化Cav1，进而调节微囊胞吞行为，增加内皮细胞和血管通透性。本实验采用LPS处理人血管内皮细胞株CRL-2922，通过免疫印迹法检测其Src蛋白表达、Cav1磷酸化、VE-Cad质膜表达，以及Cav1与VE-Cad共沉淀水平，同时采用生物半透膜检测单层内皮细胞的荧光透过率，探讨TLR4-Src途径是否参与LPS诱导微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

1 材料与方法

1.1 实验用细胞、试剂和仪器

人血管内皮细胞株CRL-2922购自ATCC (American Type Culture Collection)。VE-Cad抗体(批号：sc-6458)、Cav1抗体(批号：sc-894)和c-Src抗体(批号：sc-18)均购自美国Santa Cruz公司；Cav1 Tyr14位点磷酸化抗体(批号3251)购自美国Cell Signaling公司，异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白(FITC-BSA)、LPS(批号L2880)和β-actin(批号A5441)均购自美国Sigma公司；质膜蛋白提取试剂盒(批号：ab65400)购自美国Abcam公司；Src抑制剂SU6656(批号：572636)购自美国Merck公司，TLR4抑制剂CLI-095(批号：243984-11-4)购自美国Invivogen公司；DMEM-高糖培养基购自美国HyClone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司。培养小室(型号3452)购自美国Corning公司，

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组处理：将CRL-2922细胞株加入含15%胎牛血清、4mmol/L L-谷氨酰胺、4 500mg/L葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中，分别用25ml培养瓶和培养小室半透膜培养。当细胞生长至融合状态时，随机分为正常对照组、LPS处理组(包括1h、2h、4h、6h亚组)和LPS+抑制剂组(包括TLR4抑制剂CLI-095和Src抑制剂SU6566)，各组n均=4。正常对照组不予再处理；LPS处理组采用LPS(10μg/ml)与培养细胞再培养不同时间；LPS+抑制剂组即在LPS培养细胞时分别加入CLI-095(5μg/ml)和SU6566(2μmol/L)共同培养4h。收集各组细胞，按常规方法提取细胞总蛋白，采用Western Blotting检测各组Src蛋白表达、Cav1磷酸化、VE-Cad质膜表达，以及Cav1与VE-Cad共沉淀水平，同时检测各组内皮细胞荧光透过率(血管通透性)。

1.2.2 Src蛋白、Cav1磷酸化、VE-Cad质膜表达以及Cav1与VE-Cad共沉淀水平检测：(1)Src蛋白、Cav1磷酸化和VE-Cad质膜表达的检测：均参照常规Western Blotting，采用8% SDS-PAGE凝胶电泳，Src抗体滴度1∶1 000，Cav1磷酸化抗体滴度1∶1 000，VE-Cad抗体滴度1∶200，β-actin抗体滴度均为1∶2 000。Quantity One软件分析蛋白电泳条带，以Src蛋白、Cav1磷酸化、VE-Cad与β-actin光密度比值分别表示上述蛋白表达水平。(2)Cav1和VE-Cad免疫共沉淀：在细胞裂解液中分别加入VE-Cad抗体(1∶50)和蛋白G-琼脂糖，4℃过夜，洗涤沉淀并煮沸分离后，常规Western Blotting检测Cav1(1∶200稀释)表达，洗膜后检测VE-Cad质膜表达。以Cav1/VE-Cad电泳条带光密度值之比表示两者共沉淀水平。

1.2.3 内皮细胞通透性检测：通过单层内皮细胞荧光透过率表示细胞通透性。取细胞融合生长的培养小室，在其上腔液中加入FITC-BSA作为示踪剂，在下腔液中取样，每隔15min一次，累计2h，检测下腔液样品的荧光强度，用累计荧光透过率表示细胞通透性[4]。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 Src蛋白表达

正常对照组Src蛋白低表达(0.125±0.023)；LPS处理组Src蛋白表达均比正常对照组增高(F=5.76，P<0.05)。TLR4抑制剂组Src蛋白表达显著低于LPS处理4h组(P<0.05)。见图1。

注：与正常对照组比较,*P<0.05;与LPS处理4h组比较,#P<0.05图1 LPS处理不同时间Src蛋白表达及TLR4对其的抑制

2.2 Cav1磷酸化和VE-Cad质膜表达及其两者共沉淀水平

各组间Cav1磷酸化、VE-Cad质膜表达及Cav1与VE-Cad共沉淀水平比较均有统计学差异(F分别为6.21、8.53、5.79，P均<0.05)。正常对照组Cav1磷酸化为0.038±0.021，VE-Cad质膜表达水平为0.608±0.085，Cav1与VE-Cad共沉淀水平为0.000±0.000。LPS处理4h组Cav1磷酸化水平较正常对照组显著增高(P<0.05)，VE-Cad质膜表达较正常对照组显著降低(P<0.05)。与LPS处理4h组比较，Src抑制剂组和TLR4抑制剂组Cav1磷酸化水平均明显降低(P<0.05)，VE-Cad质膜表达均明显增加(P<0.05)，Cav1和VE-Cad共沉淀水平也明显降低(P<0.05)。见图2。

注：与正常对照组比较,*P<0.05;与LPS处理4h组比较,#P<0.05图2 各组Cav1磷酸化、VE-Cad质膜表达和两者共沉淀水平

2.3 单层内皮细胞通透性

各组间单层内皮细胞荧光透过率比较，差异有统计学意义(F=10.26，P<0.05)。与正常对照组内皮细胞荧光透过率(0.263±0.041)比较，LPS处理4h组显著增高(P<0.05)； 与LPS处理4h组比较，Src抑制剂组和TLR4抑制剂组均明显降低(P<0.05)。见图3。

注：与正常对照组比较,*P<0.05;与LPS处理4h组比较,#P<0.05图3 各组单层内皮细胞荧光透过率

3 讨 论

本实验室前期研究发现，微囊胞吞VE-Cad是LPS致血管通透性增高的重要原因，但目前尚无文献报道LPS通过何种信号途径促使内皮细胞微囊胞吞VE-Cad。根据基础研究，微囊的胞吞功能与Cav1磷酸化有关，而Src可促进Cav1磷酸化。在肺微血管内皮细胞，激活Src可导致Cav1的Tyr14位点磷酸化，促进微囊对白蛋白的胞吞，Src抑制剂PP2可以抑制Cav1的磷酸化和微囊的胞吞作用，利用基因技术使Cav1的磷酸化位点突变，也可阻断c-Src激活引起的微囊对白蛋白和霍乱毒素B的胞吞作用[1,5]。LPS作用后的血管内皮细胞，Src的表达和活性是增高的。在肺血管内皮细胞，LPS可通过结合TLR4激活Src[3]；在大鼠尾动脉内皮细胞，LPS(100ng/ml)作用8h可导致Src活化[2]。提示LPS可以通过TLR4活化Src和磷酸化Cav1，使内皮细胞微囊的胞吞功能增强。

本研究发现，LPS处理后的人血管内皮细胞，其Src蛋白表达随LPS处理时间延长而增加，Cav1磷酸化水平较正常对照组升高，VE-Cad质膜表达较正常对照组降低；采用TLR4抑制剂和Src抑制剂干预后上述增加的Src蛋白和Cav1磷酸化显著降低，降低的VE-Cad质膜表达则显著上调；而且，LPS处理还能增加单层内皮细胞通透性，TLR4和Src抑制剂能使增加的通透性明显降低。该结果与上述理论和实验基本一致，表明TLR4-Src信号途径可能参与诱导微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。

本实验只对LPS处理后Src总的蛋白表达进行了观察，未对Src磷酸化程度进行检测，对Src生物活性的评价不够充分。另外，由于实验条件限制，只采用化学药物对可能的信号途径进行了阻断，未采用基因敲除方法进一步验证。后续实验将充实上述内容，并采用免疫荧光方法检测LPS处理后Cav1与VE-Cad的共沉淀水平，进一步分析微囊对VE-Cad的胞吞作用。

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本文第一作者简介：

张 晔(1979-),男，汉族，硕士，主治医师，主要从事创伤后脏器功能损伤机制研究

1 Sounni NE, Paye A, Host L, et al. MT-MMPS as Regulators of vessel stability associated with angiogenesis[J]. Front Pharmacol，2011, 2: 111.

2 Kox M, Wijetunge S, Pickkers P, et al. Inhibition of Src family tyrosine kinases prevents lipopolysaccharide-induced hyporeactivity in isolated rat tail arteries[J]. Vascul Pharmacol，2007, 46(3): 195-200.

3 Gong P, Angelini DJ, Yang S, et al. TLR4 signaling is coupled to SRC family kinase activation, tyrosine phosphorylation of zonula adherens proteins, and opening of the paracellular pathway in human lung microvascular endothelia[J]. J Biol Chem，2008, 283(19): 13 437-13 449.

4 Zhao D, Qin L, Bourbon PM, et al. Orphan nuclear transcription factor TR3/Nur77 regulates microvessel permeability by targeting endothelial nitric oxide synthase and destabilizing endothelial junctions[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011, 108(29): 12 066-12 071.

5 Sverdlov M, Shinin V, Place AT, et al. Filamin A regulates caveolae internalization and trafficking in endothelial cells[J]. Mol Biol Cell，2009, 20(21):4 531-4 540.

Contribution of TLR4-Src Signal Pathway to Caveolae-mediated Endocytosis of VE-Cad after LPS Treatment

ZHANG Ye, ZHANG Lian-yang#, TAN Hao, LI Yang, SUN Shi-jin

State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Trauma Center of PLA, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China;#

Objective: To observe the mechanism of caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad after LPS treatment.Method: Human vascular endothelial cell line CRL-2922 was cultured. It was divided into normal control group (when it grew to confluence state), LPS-treated group (using 10μg/ml LPS to incubate with the CRL-2922 for 1h, 2h, 4h and 6h); and LPS+inhibitor group[adding CLI-095 (5μg/ml) and SU6566 (2μmol/L) in the LPS cultured cells and then culturing for 4h]. Western Blotting was used to detect the Src protein expression, Cav1 phosphorylation, plasma membrane protein expression of VE-Cad, phosphorylation of Cav1 and co-precipitation levels of Cav1 and VE-Cad; semi-permeable membrane was used to culture cells, and the relevant cells fluorescence transmittance was detected to reflect vascular permeability.Results: The protein expression of Src was gradually increased after LPS treatment, as well as the phosphorylation (Tyr14) of Cav1 and he monolayer cell permeability (P<0.05), and the membrane expression of VE-Cad decreased (P<0.05). The increased expression and phosphorylation could be decreased by the inhibitor of TLR4 CLI-095 and the inhibitor of Src SU6656 (P<0.05), and the inhibitors could increase the membrane expression of VE-Cad (P<0.05), and improve the monolayer cell permeability at 4h after LPS treatment (P<0.05).Conclusion: Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad was activated through LPS-TLR4-Src signal pathway.

Lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; Src; Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cadherin； Vascular permeability

“十二五”国家科技支撑计划(2012BAI11B01);军队“十二五”重点项目(BWS12J033)

第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室, 重庆400042;#

，电话：023-68757991，E-mail：hpzhangly@163.com

本文2014-12-15收到，2015-02-28修回

R605.971

A

1005-1740(2015)02-0001-04