缺氧诱导因子2α在肝癌中的表达及其与血管生成、上皮间质转化的关系

姚启杨，潘婷婷，许戈良，李建生，马金良，荚卫东，余继海，葛勇胜，刘文斌，任维华

缺氧诱导因子2α在肝癌中的表达及其与血管生成、上皮间质转化的关系

姚启杨1，潘婷婷2，许戈良1，李建生1，马金良1，荚卫东1，余继海1，葛勇胜1，刘文斌1，任维华1

摘要目的 研究缺氧诱导因子2α（HIF-2α）在肝细胞肝癌中的表达情况及其与血管生成和上皮间质转化（EMT）的关系。方法 收集正常肝组织15例、肝癌组织和相应的癌旁组织各63例，采用免疫组化染色法检测HIF-2α的表达，分析其表达与肝癌临床病理特征及生存预后之间的关系；同时分析肝癌组织中HIF-2α、白细胞分化抗原34（CD34）、波形蛋白（Vimentin）的表达，探究HIF-2α的表达与血管生成、EMT的关系。结果 免疫组化染色法显示HIF-2α在肝癌组织中主要在胞质表达，显著高于癌旁组织及正常肝组织（P＜0.001）。HIF-2α的表达与肿瘤最大径、肿瘤TNM分期、Edmondson分级及包膜和血管侵犯有关，与患者年龄、性别、乙肝表面抗原表达、甲胎蛋白（AFP）、Child-Pugh分级、肿瘤结节数目及肿瘤内坏死无关。相关性分析显示HIF-2α的表达与微血管密度（MVD）有关（t＝5.919，P＜0.001），与Vimentin的表达无关（r＝1.013，P＝0.209）。生存分析显示，高表达组术后总体生存率明显低于低表达组（P＜0.001）。多因素分析显示瘤内坏死、肿瘤血管侵袭和HIF-2α表达是影响肝癌患者总生存率的独立危险因素。结论HIF-2α可促进肝癌血管生成，但可能不参与EMT，可作为判断肝癌患者预后的指标之一。

关键词肝癌；缺氧诱导因子2α；血管生成，病理性；因素分析，统计学

2015－01－22接收

作者单位：1安徽医科大学附属省立医院普通外科、肝胆胰外科安徽省重点实验室，合肥 230001

2天津医科大学附属研究生学院，天津 300070

缺氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）也称为内皮PAS区域蛋白1，在多种肿瘤中发现其参与能量代谢、血管生长、侵袭转移等过程，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用［1］。该实验采用免疫组化SP法检验HIF-2α的表达是否对肝细胞肝癌的血管生成和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）产生影响，探讨HIF-2α与肝癌的发生发展及预后的关系。

1 材料与方法

1．1 病例资料 收集2008年10月～2012年7月于安徽医科大学附属省立医院行根治性手术切除且术后病理证实为肝细胞性肝癌患者的组织标本，肝癌组织和对应的癌旁组织各63例；其中男50例，女性13例，年龄31～74（54.9±11.5）岁。患者术前均未接受过介入、化疗等抗肿瘤治疗，术后未出现如大出血、胆漏、肝功能衰竭等严重并发症。其中Edmondson分级Ⅰ级14例，Ⅱ级34例，Ⅲ-Ⅳ级15例；临床TNM分期Ⅰ-Ⅱ期25例，Ⅲ-Ⅳ期38例。另取15例非肿瘤原因行肝部分切除术的肝脏组织作为对照，镜下证实为正常肝组织。

1．2 试剂 鼠抗人HIF-2α抗体购自美国Abcam公司；鼠抗白细胞分化抗原34（CD34）、波形蛋白（Vimentin）抗体、辣根过氧化物酶标记的通用型二抗和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1．3 免疫组化染色法 标本常规行石蜡切片，切片厚度4 μm；每张切片先行HE染色，再按照试剂盒说明书进行SP法染色。阴性对照以PBS液代替一抗。结果判定：Vimentin和HIF-2α蛋白以细胞质中出现黄色颗粒视为阳性表达。染色判定采用半定量计数法，即低倍镜（10×10）视野下检测染色强度（0 ～3分依次为无、弱、中、强），高倍镜（40×10）下随机选取10处视野根据肝癌阳性细胞比例即＜5%、5%～25%、26%～50%、＞50%依次评为0、1、2、3分；将两项得分相乘即为最后得分，＜4分为低表达，≥4为高表达；将HIF-2α染色判定得分＜4分者纳入HIF-2α低表达组，≥4分者纳入HIF-2α高表达组。CD34染色以血管内皮细胞的细胞膜或细胞质出现棕黄色或棕褐色为阳性，以肿瘤内微血管密度（micro vessel density，MVD）的大小来判断新生血管表达情况［2］：低倍镜（10×10）下选择血管分布最密区，高倍镜（10×20）下选取5个视野计数染色的血管数目，计算平均值即为MVD，其中血管直径较大或血管壁厚者不计数。

1．4 统计学处理 采用SPSS 16．0软件进行分析。

率的比较采用χ2检验和Person相关性分析，均数的比较采用t检验。累积生存率采用Kaplan-Meier法，单因素分析预后采用Log-rank检验，多因素分析采用Cox回归模型，比较相对危险度（relative risk，RR）和95%CI。

2 结果

2．1 肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织中HIF-2α的表达 免疫组化染色法显示HIF-2α主要在肝癌细胞的胞质中表达。见图1。在肝癌组织中高表达率为74.6%（47／63），显著高于癌旁组织（30.2%，19／63）及正常肝组织（13.3%，2／15）（χ2＝24.945、19.473，P＜0.001）。HIF-2α的高表达与肝癌患者临床病理特征分析发现，HIF-2α的高表达与肿瘤最大径（χ2＝4.826，P＝0.028）、TNM分期（χ2＝4.665，P＝0.031）、Edmondson分级（χ2＝6.537，P ＝0.038），包膜侵犯（χ2＝6.932，P＝0.008）及血管侵犯（χ2＝4.701，P＝0.030）有关，而与患者年龄、性别、乙肝表面抗原表达、甲胎蛋白（a-fetopretein，AFP）、Child-Pugh分级、肿瘤结节数目及肿瘤内坏死无关。见表1。

表1　HIF-2α的表达与肝癌临床病理特征的相关性

2．2 肝癌组织中HIF-2α表达与CD34、Vimentin的表达的相关性 CD34主要在肿瘤血管内皮细胞中表达。见图1。免疫组化染色法显示，HIF-2α高表达组的肝癌组织中MVD（60.850±20.381）明显高于低表达组的MVD（35.240±18.598），差异有统计学意义（t＝5.919，P＜0.001），说明肿瘤坏死周边HIF-2α高表达。Vimentin主要在肝癌细胞的胞质中表达，呈棕黄色颗粒，其在肝癌组织中高表达率69.8%（44／63），HIF-2α的表达与Vimentin的表达无相关性（r＝1.013，P＝0.209）。见图1。

2．3 HIF-2α表达与患者总体生存率的关系 入组病例均有完整的随访资料，随访时间2～62个月，中位随访时间为21.2个月。HIF-2α高表达组1年、3年累积生存率分别为53.2%和10.6%，相对低表达组为87.5%和37.5%。Log-rank检验分析表明HIF-2α高表达组比低表达组预后更差（χ2＝15.686，P＜0.001），见图2。Cox回归模型显示TNM分期、包膜侵犯、肿瘤最大径及病理分级不是影响患者术后总体生存率的独立因素；瘤内坏死（RR＝1.851，95%CI：1.168～2.933，P＝0.009）、肿瘤血管侵袭（RR＝1.929，95%CI：1.173～3.171，P ＝0.010）和HIF-2α表达（RR＝3.964，95%CI：2.235～7.028，P＜0.001）是影响肝癌患者总生存率的独立危险因素。见表2。

表2　多因素分析影响肝细胞肝癌患者预后的因素（Cox回归模型）

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，在常见恶性肿瘤发生率中位居第五位，其发生率在逐年上升［3］。目前认为外科手术切除是治疗肝癌的首选和最有效的方法，但远期疗效不佳，术后5年生存率仅为34.8%［4］。肿瘤的侵袭转移和复发是影响肝癌患者生存的主要因素，探究肝癌发生发展的分子机制对改善患者预后和提高患者生存率有十分重要的意义。

HIF-2α是bHLH-PAS超家族成员之一，可介导调节下游多种基因，进而促进肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞的凋亡、促进肿瘤细胞增殖、参与EMT过程及调节肿瘤干细胞生物学特性［5］。在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、恶性胶质瘤等［6］多种肿瘤组织中发现HIF-2α的表达显著升高，但其在肝癌组织的表达国内外研究不一，Yang et al［7］认为HIF-2α的高表达是肝癌预后不良的一个独立危险因素，但与临床病理关系并不密切；Sun et al［8］认为HIF-2α的高表达有抑制肝癌生长的作用。因此需要多中心、多样本的研究来排除实验的假阳性和假阴性。

本实验免疫组化染色法显示HIF-2α在肝癌中表达明显高于癌旁组织和正常组织。临床病理分析显示HIF-2α高表达和肿瘤的增殖、侵袭转移有关，与研究［9］结果相似。HIF-2α在肝癌组织中表达上调可能与肝癌组织慢性缺血低氧及抑癌基因VHL的失活有关。

相关性研究表明肝癌组织中HIF-2α的表达与MVD相关，提示HIF-2α的表达与肝癌新血管的生成呈正相关性。新生血管的生成过程包括细胞外基质降解，内皮细胞迁移、增殖和管腔形成，而新生血管生成不仅仅与肿瘤供氧有关，与肿瘤的侵袭转移也密切相关。目前认为HIF-2α促肿瘤血管生成可能机制包括［10-13］：①调控血管内皮生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，同时可增强内皮细胞中VEGF受体转录，促进VEGF与受体结合，参与血管的生成；②调控VEGF外的血管生成因子的表达，如IL-8和CD82，前者参与肿瘤的血管生成及肿瘤生长转移，后者可降低肿瘤细胞的运动活性，增加内皮细胞迁徙能力促进血管生成；此外HIF-2α可调控低氧诱导促有丝分裂因子表达，后者本身除了有强缩血管作用外，还可促进血管生成和血管增生；③调控VEGF受体外的血管生成因子受体的表达如促进血管生成素受体2的表达。

EMT过程在肝癌的转移过程中有重要的作用，低氧环境可诱导肝癌发生EMT过程，体外实验［6，14］表明HIF-2α可调控Snail、twist、Nanog、Oct3／4等基因进而参与EMT过程，但本实验显示在肝癌中HIF-2α的表达与Vimentin的表达并无相关性，提示在肝癌中HIF-2α的表达与EMT过程之间的关系并不显著，可能由于EMT本身是肿瘤发展的一个瞬时过程，而免疫组化染色也是一种“快照”技术，有捕捉不到的可能性，因此进一步的研究是必要的。

此外，生存分析显示低表达HIF-2α的患者术后累积生存率明显优于高表达的患者，多因素分析显

示HIF-2α高表达是影响肝癌术后生存的独立危险因素。综上所述，HIF-2α蛋白表达在肝癌组织和正常肝组织中差异有统计学意义，HIF-2α与肝癌促血管生成和侵袭转移的发生有关，同时HIF-2α可作为判断肝癌患者预后的有效生物学指标，可能为肝癌的治疗提供新的有潜力的靶点。

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Expression of hypoxia-inducible factor-2α in hepatocellular carcinoma and its relationship with epithelial-mesenchymal transition and angiogenesis

Yao Qiyang1，Pan Tingting2，Xu Geliang1，et al
（1Anhui Province Key Laboratory of Hepatopancreatobiliary Surgery，Dept of Hepatic Surgery，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001；2Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjing 300070）

AbstractObjective To explore the expression of hypoxia-inducible factor-2α（HIF-2α）in hepatocellular carcinoma and the relationship with epithelial-mesenchymal transition（EMT）and angiogenesis．Methods The expressions of HIF-2α in 63 cases of hepatocellular carcinoma tumor tissues and 15 normal liver tissues were examined by immunohistochemistry．To assess the relationship between the expressions of HIF-2α，EMT and angiogenesis，the expressions of CD34 and Vimentin were detected in hepatocellular carcinoma．Results Immunohistochemistry showed that HIF-2α mainly expressed in the cytoplasm，the rate of HIF-2α overexpression in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than the other two groups（P＜0.001）．The expression of HIF-2α was correlated with tumor size，TNM stages，Edmondson grade，capsule or vascular invasion．HIF-2α expression had a significantly positive correlation with microvascular density（t＝5.919，P＜0.001），but not vimentin（r＝1.013，P＝0.209）．Survival analysis showed that the prognosis was poor in patients with HIF-2α overexpression（P＜0.001）．Cox regression demonstrated that the expression of HIF-2α，tumor necrosis and vascular invasion were the independent risk factors for cumulative survival in hepatocellular carcinoma patients．Conclusion HIF-2α can promote angiogenesis，but may not participate in EMT．It may be a potential tumor marker for prognosis of hepatocellular carcinoma．

Key wordscarcinoma，hepatocellular；HIF-2α；angiogenesis，pathologic；factor analysis，statistical

作者简介：姚启杨，男，硕士研究生；许戈良，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：xugeliang2007＠163．com

基金项目：安徽省科技计划项目（编号：1106c0805028）

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）04－0491－04

中图分类号R 735．7