水溶性 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒的水热合成及生物偶联

2015-03-02孙振刚华瑞年

发光学报 2015年2期

肇欣，孙振刚，张伟，华瑞年*

(1.辽宁师范大学化学化工学院，辽宁大连 116029;2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600)

1 引言

自从上世纪90年代以来，由于化学、物理和材料在纳米领域的快速发展，导致了“纳米科学和纳米科技”这一新兴学科的出现。作为21世纪的关键性技术，纳米技术涉及到多学科交叉的研究领域。在这一领域中，尤其是高质量的单分散无机纳米晶对形貌和比表面积的性质依赖，以及这一性质在光学、催化、生物传感和数据存储上的应用已经得到了极大的发展。稀土离子独特的4f电子结构使稀土纳米材料具有很多独特的性质。稀土上转换发光纳米材料(Upconversion nanoparticles，UCNPs)已成为当前发光学领域的研究热点［1-2］。

稀土掺杂氟化物上转换纳米发光材料具有毒性小、自荧光背景低、发射峰窄、化学性质稳定等特点，在红外光光催化、光动力学治疗、荧光探针和生物医学等领域具有广阔的应用前景［3-7］。传统的荧光探针(如有机颜料)由于采用短波激发光源和相对较高的荧光漂白速率，因而具有较高的背景荧光并只能用于短时间内的成像［8］。与传统发光标记物相比，UCNPs具有化学稳定性好、毒性低、发光强度高和Stokes位移大等优点。另外，UCNPs的激发光为红外光，不会损伤生物体也不会激发出背景荧光，信噪比高，非常有利于活体生物成像［9-11］。NaYF4是近年来发现的一种理想的上转换基质材料，具有较低的声子能量，能降低多声子弛豫率，提高上转换发光效率，稀土氟化物β-NaYF4被公认为是一种优质的上转换发光材料［12-14］。2010 年，喻学峰等［15］合成了一系列大半径稀土离子(La3+、Ce3+、Pr3+、Nd3+、Sm3+、Eu3+和Gd3+等)掺杂的水溶性六方相NaYF4纳米棒，六方相 NaYF4∶(Yb，Er)/La 和 NaYF4∶(Yb，Er)/Ce纳米棒表现出比立方相更高的上转换荧光效率。在目前报道的所有 UCNPs中，NaYF4∶Yb，Er/Tm的上转换效率是最高的。可以用于生物检测的上转换荧光标记物也主要是 Yb/Er和Yb/Tm共掺杂的NaYF4纳米粒子。NaYF4属于多晶型的复合稀土氟化物，具有亚稳相——立方相(α-NaYF4)和稳定相——六方相(β-NaYF4)两种晶体结构。六方相 NaYF4∶Yb，Er/Tm相对于其立方相材料，上转换发光效率要高一个数量级。

本文利用一步水热法合成出氨基表面修饰、单分散性好、尺寸小、发光性能优异的水溶性β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+上转换纳米棒，用X射线粉末衍射仪(XRD)、扫描电子显微镜 (SEM)、透射电子显微镜(TEM)和荧光光谱(PL)等手段对制备的样品进行了表征，并通过戊二醛法将BSA生物分子与所制备的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+上转换纳米棒成功偶联。

2 实验

2.1 试剂

分析纯氯化钠(NaCl)、无水乙醇(C2H5OH)、氟化铵(NH4F)、聚乙烯亚胺(PEI)、牛血清蛋白(BSA)、戊二醛(25%，质量分数)、磷酸(H3PO4)、考马斯亮蓝(G-250)、磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O和磷酸二氢钠 NaH2PO4·12H2O等均购于天津科密欧化学试剂有限公司。Y2O3(99.99%)、Gd2O3(99.99%)、Yb2O3(99.99%)和 Er2O3(99.99%)均购于上海第二化学试剂厂。氯化钆(GdCl3·6H2O)、氯化镱(YbCl3·6H2O)、氯化钇(YCl3·6H2O)和氯化铒 (ErCl3·6H2O)均为自制，即将相应的稀土氧化物溶于6 mol/L HCl中，重结晶4次获得。

2.2 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒的制备

称取0.058 4 g NaCl(1 mmol)、0.115 2 g YCl3·6H2O(0.38 mmol)、0.077 5 g YbCl3·6H2O(0.20 mmol)、0.007 63 g ErCl3·6H2O(0.02 mmol)和0.148 6 g GdCl3·6H2O(0.40 mmol)溶于10 mL去离子水中得到溶液A，再称取0.296 0 g NH4F(8 mmol)溶于10.0 mL去离子水中得到溶液B，量取10mL质量浓度为0.05 g/mL的PEI溶液和30 mL无水乙醇混合在50 mL烧杯中得到溶液C。在不断搅拌下，将溶液C缓慢滴加到溶液A中。搅拌30 min后，再将溶液B缓慢滴加到其中，10 min内完成滴加，再缓慢匀速搅拌20 min。将上述溶液倒入100 mL不锈钢反应釜，放在烘箱中，温度调至200℃，加热8 h后，关闭烘箱，取出反应釜，自然冷却至室温。将产物在9 000 r/min的转速下离心10 min，用无水乙醇洗涤4次，获得的沉淀在80℃下干燥，得到的白色粉末即为表面有氨基修饰的水溶性β-NaY0.38Gd0.4F4∶20%Yb3+，2%Er3+纳米棒。

2.3 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+与 BSA 偶联产物的制备

准确称取10 mg所制备的 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒溶解在2.0 mL去离子水中，超声分散30 min后，在3 000 r/min的转速下离心，上清液倒出以备后续实验中使用。将有少量沉淀的离心管放入烘箱中，干燥后称其质量，用于计算溶解于水中的样品的质量。将1 mg的BSA加入到上清液中，在室温下搅拌2 h后，再将0.10 mL戊二醛(25%，质量分数)滴加到上述溶液中，在室温下缓慢搅拌5 h。将产物在9 000 r/min的转速下离心，并用磷酸缓冲溶液(10 mmol/L，pH=7.4)洗涤3次，最后定容在2.0 m L的磷酸缓冲溶液中。

2.4 实验仪器

日本岛津公司产XRD-6000型X射线粉末衍射仪，铜靶(λ=0.154 06 nm);日本日立公司产S-4800型场发射扫描电子显微镜;日本电子公司JEM-2010型透射电子显微镜;日本Horiba公司产SZ-100-Z型激光粒度分析仪;日本日立公司F-4600型荧光光谱仪;日本岛津UV-2450紫外光谱仪;上海美谱达仪器有限公司产UV-6100紫外-可见分光光度计。摩尔分数为40%条件下制得的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒样品的粉末X射线衍射(XRD)谱。从图中可以看出，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒的衍射峰与β-NaYF4的标准卡片完全一致，没有出现其他杂质峰，表明产物物相纯净、结晶良好。在该反应条件下，如果不引入大半径的Gd3+，产物为 α-NaYF4和 β-NaYF4混相产物;随着Gd3+离子掺杂量的增大(至Gd3+的摩尔分数到30%)，仍得不到纯相的 β-NaYF4(产物为 β-NaYF4和少量的α-NaYF4)。该实验结果表明，当引入一定量大半径的Gd3+后，在较短的反应时间内，有利于α-NaYF4向β-NaYF4相转变，并最终获得纯相的β-NaYF4纳米棒。

3 结果与讨论

3.1 物相结构分析

图1为反应温度200℃、反应时间8 h、Gd3+

图1 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒的XRD谱Fig.1 XRD pattern ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+nanorods

3.2 形貌分析

在室温下，通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜对合成的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒的形貌进行了观测，如图2所示。

从图2可以看出，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+样品的形貌为规则的实心六棱柱型纳米棒，截面粒径平均约为40 nm，平均长度约为210 nm。偶联BSA后的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+表面覆盖了一层物质，因此形貌发生了变化，但粒径大小没有发生明显改变。

3.3 荧光光谱分析

图3是在980 nm激发下的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒的上转换发光光谱。谱图显示了4个明显的发射带，发射中心位于407，529，546，660 nm，分别对应于2H9/2→4I15/2、2H11/2→4I15/2、4S3/2→4I15/2和4F9/2→4I15/2跃迁。图 4 是 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒的上转换发光机理图。Er3+的基态能级是4I15/2，当用980 nm的红外激光器激发样品时，电子跃迁至4I11/2能级，Yb3+发生2F7/2→2F5/2跃迁，激发到2F5/2能级的电子通过声子参与的非共振能量转移把能量转到Er3+的4I11/2能级上。Er3+可吸收第2个光子或吸收邻近已处于2F5/2能级的电子的能量，再次跃迁至2H11/2和4S3/2能级，返回基态能级4I15/2时分别发出529 nm和546 nm的绿光;另有一部分到达4S3/2能级的电子经无辐射跃迁至4F9/2能级，由4F9/2能级返回基态时发出660 nm的红光。

图2 样品 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的SEM 照片(a)和透射电镜照片(c)，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+偶联BSA后的SEM照片(b)及β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的粒径分析图(d)。Fig.2 SEM image(a)and TEM image(c)ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+，SEM image(b)ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+conjugated with BSA，and particle size distribution ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+(d).

图4 β-NaYF4∶Yb3+/Er3+的上转换发光机理图Fig.4 Upconversion luminescence mechanism diagram ofβ-NaYF4∶Yb3+/Er3+

图3 样品 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的荧光谱 (λex=980 nm)Fig.3 Fluorescent spectrum ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+(λex=980 nm)

3.4 紫外光谱分析

作为有机功能分子，聚乙烯亚胺(PEI)被选作修饰β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒表面的有机功能分子。因PEI结构中含有氨基，并且可进一步与BSA偶联。PEI修饰的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒能够很好地分散在水溶液中(溶解度约为1 mg/mL)，其表面氨基的存在非常适合于生物和生物医学应用。图5的紫外-可见吸收光谱进一步证实了 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒样品已与BSA成功偶联。在BSA的紫外标准光谱中，位于276 nm和208 nm的峰被指认为BSA中的色氨酸残基和肽键的吸收峰。在 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI-BSA 的紫外光谱中也可以观察到276 nm和208 nm处的吸收峰，然而在 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI的紫外光谱中却没有出现这两个吸收峰。这一实验结果初步证实了BSA与β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI纳米棒的成功偶联。

3.5 考马斯亮蓝法定量分析蛋白含量

用布拉德福德试剂(100 mg的考马斯亮蓝G-250在50 mL的95%乙醇中溶解，然后加入120 mL的85%磷酸，用水稀释至1.0 L)与BSA发生颜色反应，进一步定量地验证 BSA是否与 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI纳米棒偶联。考马斯亮蓝G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中含磺酸基的蓝色染料，在465 nm处有最大的吸收值。因此，布拉德福德试剂能吸收465 nm可见光，布拉德福德试剂与BSA蛋白结合物可以吸收595 nm可见光，其吸光度值与蛋白质含量成正比。这种变化通过紫外光谱分析法可以用来量化样品中BSA蛋白的含量。

首先，配制BSA的标准溶液，浓度分别为0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL 的 BSA 溶液各1.00 mL。然后，向上面的BSA溶液中分别加入5.00 mL的布拉德福德试剂。2 min后，用布拉德福德试剂-BSA偶联物的蛋白质溶液在595 nm处进行吸光度的测定，测定的值依次为0，0.145，0.294，0.403，0.565，0.652。最后得到在0.0 ～0.1 mg/mL浓度范围内的吸光度与BSA的浓度的线性关系，如图6所示。回归方程可以表示如下:

Y=6.6129X+0.0125，(R2=0.995 1)， (1)式中，X为BSA浓度，Y为吸光度。经测定，样品β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI-BSA 的吸光度为0.127，根据蛋白质标准曲线计算出β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI表面的BSA偶联率为1.73%(含BSA 0.017 3 mg/mL)。这个结果进一步表明，BSA 与 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI纳米粒子偶联成功。

图6 在595 nm吸收波长下，BSA的浓度与吸光度的关系曲线。Fig.6 Linear relationship between the concentration of BSA and absorbance at595 nm

4 结论

以聚乙烯亚胺(PEI)为表面活性剂，采用水热法，在Gd3+的摩尔分数为40%、反应温度为200℃、时间为8 h的条件下制得了纯相的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒。纳米棒的平均截面粒径约为40 nm，平均长度约为210 nm。偶联BSA后的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+表面覆盖了一层物质，因此形貌发生了变化，但粒径大小没有发生明显改变。当用980 nm波长激发样品后，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒的上转换光谱中出现了4个明显的发射带，发射中心位于 407，529，546，660 nm，分别对应于2H9/2→4I15/2、2H11/2→4I15/2、4S3/2→4I15/2和4F9/2→4I15/2跃迁。采用戊二醛法，使得蛋白(BSA)上的氨基与 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒表面的氨基牢固地键合在一起，并通过紫外光谱分析和考马斯亮蓝法证明了β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒与 BSA偶联成功。根据考马斯亮蓝法算出 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒与 BSA的偶联率为1.73%(0.017 3 mg/mL)。该研究为将 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+纳米棒应用于生物分子分析、细胞标记及成像提供了实验参考。

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