金针菇菌糠中木聚糖酶的分离纯化及其酶学性质研究

杨云龙，黄彩梅，白植成，胡开辉

(福建农林大学生命科学学院，福建福州350002)



金针菇菌糠中木聚糖酶的分离纯化及其酶学性质研究

杨云龙，黄彩梅，白植成，胡开辉*

(福建农林大学生命科学学院，福建福州350002)

摘要：废弃食用菌栽培料(SMC)中含有一定活性的木聚糖酶，作者以金针菇菌糠为材料，采用盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE C-52离子交换层析等技术，对SMC中的木聚糖酶进行分离和纯化，并进行酶学性质研究。结果表明，该酶经SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯，分子量为37.8 KDa，酶比活力达到946.67 U/mg，纯化倍数为12.74；酶的最适温度和pH分别为50 ℃和pH 6.0，Fe2+、Zn2+对木聚糖酶有激活作用，Ca2+、Mn2+、K+有促进作用，Mg2+、Cu2+、Fe3+有抑制作用，反应动力学参数Vmax和Km分别为15.43 μg/mL/min、9.61 mg/mL。

关键词：木聚糖酶；分离纯化；酶学性质

伴随着我国食用菌产业蓬勃发展，每年产生的废弃食用菌栽培料 (Spent Mushroom Compost,SMC) 的数量巨大，并且呈现出逐年增加的趋势。因此如何处理SMC已成为我国突出的问题。如果SMC仅仅被当做农业垃圾随意丢弃或者焚烧，这样不但会对环境造成恶劣的影响，而且是一种有机资源的浪费[1-2]。越来越多的研究表明SMC存在着许多潜在的利用价值[1,3]。食用菌在生长过程能够分泌多种生物酶，有趣的是这些酶不易失活，因此食用菌收获后的SMC中仍然含有一定酶活的生物酶。据研究报道，SMC中具有纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、漆酶、多酚氧化酶等[4]，其中木聚糖酶引起了我们的兴趣。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中的关键酶[5]，可将木糖聚合物降解为寡聚木糖、木糖及其他单糖。不同最适温度和pH值的木聚糖酶在食品[6]、饲料[7]、造纸[8]等行业上有不同的应用。pH值在3.5～6.0，反应温度为40 ℃～60 ℃的木聚糖酶可以降低酿造和饲料中物料的粘度，促进营养物质的吸收利用；耐高温耐碱性的木聚糖酶可以改善纸张的脆性等性能。木聚糖酶的来源主要有真菌、细菌、放线菌等。国外关于木聚糖酶的研究主要集中在基因的分子克隆与表达、发酵诱导与控制机制、纯化鉴定等方面[9]；国内则侧重于产木聚糖酶菌株的筛选与驯化[10]、工程菌的构建、培养条件优化、酶学性质以及酶的纯化[11]等方面，然而对SMC中的木聚糖酶的研究报道并不多见。

本研究将通过盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE C-52离子交换层析等技术从金针菇SMC中分离提纯木聚糖酶，并在此基础上探究木聚糖酶的酶学性质。为SMC中木聚糖酶的提取开发利用提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

金针菇SMC。金针菇初始培养基配方：棉籽壳35%，木渣15%，杂木屑10%，稻草5%，麸皮12%，玉米粉10%，米糠7%，石灰3%，石膏(高强度)1%，钙镁磷肥2%，pH 7～8，,含水量65%。

1.2试剂

3,5-二硝基水杨酸(DNS)，化学纯，国药集团化学试剂有限公司产品；桦木木聚糖，Sigma公司产品；Sephadex G-100，上海宝曼生物科技有限公司产品；DEAE C-52，GE Healthcare公司产品；Marker，生物工程有限公司产品；其他试剂均为市售，分析纯。

1.3仪器

DYCZ-24EN型双垂直电泳仪，北京六一仪器厂；Eppendorf Centrifuge 5804R冷冻离心机，上海富众生物科学有限公司。

1.4方法

(1)硫酸铵盐析。金针菇SMC粉碎后拌至混匀，按1∶3加入0.02 mol/L pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，常温静置3 h。纱布过滤，4 ℃，10 000 r/min离心20 min，收集上清为粗酶液。采用20%～80%饱和度硫酸铵分级沉淀，4 ℃静置24 h，10 000 r/min离心20 min，收集沉淀。透析，冷冻浓缩。

(2)Sephadex G-100层析。用缓冲液平衡Sephadex G-100，取适量的粗酶液上柱，平衡缓冲液洗脱，流速为1.5 mL/min，1 mL/管。收集并检测各管酶活力，合并有酶活管并冷冻浓缩。

(3)DEAE C-52阴离子交换层析。在离子交换层析中，常常采用改变洗脱液pH值和增加洗脱液的盐浓度方法，以达到分离蛋白质的作用。选择pH 7.0缓冲液平衡DEAE C-52层析柱和最佳的洗脱盐浓度进行梯度洗脱，收集各洗脱峰。检测各管酶活力，收集有酶活管并冷冻浓缩。

(4)SDS-PAGE。配制12%的分离胶，4%的浓缩胶，制胶。加入处理后酶液20 μL，电泳100 V，4 h。

(5)酶学性质分析。在测定酶活力反应体系中，测定木聚糖酶的最适反应温度、温度稳定性、最适反应pH和酸碱稳定性。

(6)酶催化反应的动力学性质研究。根据Michaelis-Menten公式，改变底物Xylanase的浓度[S]，测定酶促反应动力学的反应初始速度v，得出米氏常数Km和最大反应速度Vmax。

(7)金属离子对木聚糖酶活的影响。酶液中加入分别含1 mmol/L、10 mmol/L的Na+、K+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+，探究不同价位的金属离子对木聚糖酶活力的影响。

(8)木聚糖酶活力测定。采用DNS法测定木聚糖酶活力。配制不同浓度的木糖标准溶液，绘制木糖标准曲线。取酶液0.15 mL，加入木聚糖溶液0.2 mL，50 ℃反应30 min，加入DNS 0.35 mL，沸水浴15 min，流水冷却，用缓冲液定容至7 mL。以灭火酶液为参照管调零，540 nm测定吸光值。木聚糖酶活力单位定义[12]：在50 ℃ pH6.0的反应条件下，1 mL酶液1 min内水解木聚糖，生成1.0 μg还原糖定义为1个酶活力单位(U)。

2结果与分析

2.1Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析

图1　木聚糖酶的Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析Fig.1　Purification of the Xylanase by Sephadex G-100

将硫酸铵盐析液经Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析(图1)，有两个洗脱峰，检测各管酶活，发现第一个洗脱峰含有较高木聚糖酶活，将这些管收集冷冻干燥后用于下一步分离纯化。

2.2DEAE C-52 离子交换层析

(1)用pH 7.0 Tris-HCl缓冲液平衡DEAE C-52，选择含有NaCl浓度分别0，0.2和1 mol/L的相应的缓冲液进行盐离子梯度洗脱，收集并检测酶活。结果见图2，含有木聚糖酶活力的蛋白主要集中在第5个峰，即约在NaCl浓度为0.8 mol/L洗脱时的色谱峰。因此，选用含有NaCl浓度分别为0，0.2和0.8 mol/L的平衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱。

(2)将酶液经DEAE C-52 层析柱(图3)，有3个洗脱峰，检测各管酶活，发现第3个洗脱峰含有较高木聚糖酶活，将这些管收集冷冻干燥后用于下一步分离纯化。

图2　DEAE C-52离子交换层析缓冲液pH值的确定Fig.2　The selection of buffer pH for DEAE C-52

图3　木聚糖酶的DEAE C-52阴离子交换层析Fig.3　Purification of the Xylanase by DEAE C-52

2.3木聚糖酶纯度的鉴定

电泳条带从右往左分别为：M：Marker；Ⅰ：粗酶液；Ⅱ：Sephadex G-100凝胶层析浓缩酶液；Ⅲ：DEAE C-52离子交换层析浓缩酶液。结果见图4，SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯，分子量约为37.8 KDa。

2.4分离纯化结果

木聚糖酶的分离纯化结果如表1所示，Sephadex G-100层析后，比活力为771.18 U/mg，纯化倍数为10.39,酶的回收率为32.02%；再经DEAE C-52层析后，比活力为946.67 U/mg，纯化倍数为12.75，酶的回收率为3.09%。

2.5酶学性质分析

图4　SDS-PAGE 电泳图谱Fig.4　SDS-PAGE of the purified Xylanase

(1)改变反应温度，测定不同温度下木聚糖酶催化反应的活力大小。结果表明(图5)，酶活随着温度的升高而增大，50 ℃之后呈逐渐下降的趋势，说明木聚糖酶最适反应温度为50 ℃。

(2)酶液经不同温度处理30 min，迅速冷却至室温，测定残余酶活力。结果表明(图6)，酶在20～50 ℃稳定性较好，温度大于50 ℃相对酶活呈下降，至90 ℃时，相对酶活还剩下55%。说明此木聚糖酶的耐高温域较广。

(3)改变酸碱缓冲体系，测定不同pH值下酶促反应的活力大小。结果表明(图7)，酶活随着pH的升高而升高，至pH大于6.0时，酶活开始随pH值的升高而降低，说明木聚糖酶的最适反应pH值为6.0。

(4)冷冻干燥后的酶粉末经不同pH值缓冲液溶解，测定残余酶活力。结果表明(图8)，酶在pH为3.0～8.0内相对稳定，说明此木聚糖酶具有很好的酸碱稳定性。

表1　木聚糖酶的分离纯化

图5　酶促反应的最适反应温度Fig.5　The optimum reaction temperature

图6　温度对酶促反应的稳定性的影响Fig.6　The effect of temperature stability

图7　酶的最适反应pH值Fig.7 The optimum reaction pH

图8　pH值对酶的稳定性的影响Fig.8　The effect of pH stability

2.6木聚糖酶的动力学研究

图9　木聚糖酶催化木聚糖水解的Lineweaver-Burk双倒数图Fig.9　The Lineweaver-Burk piot of the enzymefor the hydrolysis of Xylan

以1/v与1/[S]作酶解反应的Lineweaver-Burk双倒数图(图9)，两者呈直线，以羧甲基纤维素钠为底物的酶促反应的Vmax和Km分别为15.43 μg/mL/min和9.61 mg/mL，Vm/Km为1.61。

2.7金属离子对木聚糖酶活的影响

不同金属离子对酶活性影响见图10，Na+在低浓度下对该酶有轻微的促进作用，随着离子浓度的提高，表现出轻微的抑制作用；Fe2+、Zn2+对该酶有激活作用；Ca2+、Mn2+、K+对该酶有促进作用；Mg2+、Cu2+、Fe3+表现出强烈的抑制作用。

3讨论

图10　金属离子对木聚糖酶的影响Fig.10　The effects of different metal ionson the Xylanase activity

目前，在工业上主要选用霉菌作为生产木聚糖酶菌株，先发酵再分离纯化[10]。而我们采用Sephadex G-100凝胶层析和DEAE C-52离子交换层析等纯化方法，从金针菇SMC中直接获得了木聚糖酶，经SDS-PAGE鉴定纯度，得到单一条带，即纯度达到电泳纯。酶比活力达到946.67 U/mg，纯化倍数为12.75，回收率为3.09%。用里氏木霉等菌株发酵生产的木聚糖酶[11,13]，所需的成本费高，酶产品价格贵，不利于木聚糖酶的普及应用。吴萍等[14]用金针菇固态发酵7 d后从培养基中分离纯化得到的木聚糖酶，酶比活力达到102.1 IU/mg，纯化倍数为9.4，具有较好的应用前景。然而本研究中的SMC来源丰富、价格廉价，可直接回收木聚糖酶，大大降低木聚糖酶的生产成本，更能促进木聚糖酶的应用。不同生物来源的木聚糖酶的结构不尽相同，其酶学性质也有所区别[15]。我们从金针菇SMC中提取的木聚糖酶的最适反应温度为50 ℃，在20～50 ℃热处理30 min后酶活力基本没有损失，温度上升到80 ℃及以上时，酶活力仍有74%；在pH在3.0～8.0的范围内相对稳定。这与吴萍等[14]分离纯化得到的木聚糖酶，其酶学性质相一致。说明该酶具有较广的耐酸碱能力和耐高温能力，适合应用于纸浆和造纸工业[8]。

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《江西农业大学学报》再次入选中国科学

引文数据库(CSCD)

经过中国科学引文数据库(CSCD)定量遴选、学科专家评审和中国科学引文数据库来源期刊遴选委员会的评议，我校《江西农业大学学报》再次被收录为 “中国科学引文数据库(CSCD)来源期刊”(2015至2016年度)。

中国科学引文数据库(简称CSCD)创建于1989年，被誉为"中国的SCI"，是ISI Web of Knowledge平台上第一个非英文语种的数据库，已在我国科研院所、高等学校课题查新、基金资助、项目评估、成果申报、人才选拔等多方面作为权威文献检索工具获得广泛应用。主要被用于自然基金委国家杰出青年基金指定查询、自然基金委国家重点实验室评估查询、中国科学院院士推选人查询库、教育部学科评估查询库、教育部长江学者推选人查询库、中科院百人计划推选人查询库等。

(期刊社)

Purification and Properties of Xylanase from Spent Mushroom

Compost ofFlammulinavelutipes

YANG Yun-long，HUANG Cai-mei，BAI Zhi-cheng，HU Kai-hui*

(College of Life Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fu Zhou,350002，China)

Abstract:Xylanase produced by Spent Mushroom Compost was isolated and purified by ammonium sulfate salting-out,Sephadex G-100 column chromatography and DEAE C-52 anion chromatography exchange,and its enzymatic properties were studied.The results illustrated that it exhibited a single band by the SDS-PAGE，and the molecular weight was estimated as 37.8 KDa.The purification made the specific activity as high as 946.67 U/mg and purification multiple reached 12.74.The optimal temperature and pH value for activity were 50 ℃ and pH 6.0 respectively,which had a certain acid and alkali resistance and high-temperature-resisting.Xylanase obtained in this study was activated by Fe2+and Zn2+;promoted by Mn2+,K+and Ca2+;while inhibited by Mg2+,Cu2+and Fe3+.The Vmaxand Kmvalues of the xylanase for xylan were 15.43 μg/mL/min and 9.61 mg/mL,respectively.The study suggests that this xylanase has a good potential to be a cold-stable xylanase in paper manufacturing and feed industries.

Key words:xylanase;purification;enzymatic properties

作者简介：杨云龙(1979—)，男，讲师，博士生，主要从事生物脱氮方面的研究工作,E-mail:longyunyang@126.com;*通信作者：胡开辉，教授，E-mail:474585312@qq.com。

基金项目：国家自然科学青年基金项目(21407024)和福建省教育厅项目 (JA14122)

收稿日期：2015-04-27修回日期：2015-06-18

中图分类号：S646.1+5;Q936

文献标志码：A

文章编号：1000-2286(2015)06-1094-06

杨云龙，黄彩梅，白植成，等.金针菇菌糠中木聚糖酶的分离纯化及其酶学性质研究[J].江西农业大学学报，2015，37(6)：1094-1099.