纳米银联合辐射后脑胶质瘤细胞凋亡与小胶质细胞的变化及其关系

刘培党，金海振，赵静，唐萌

(1.东南大学医学院 神经生物学研究所，江苏 南京 210009； 2.东南大学 江苏省生物材料与器件重点实验室，江苏 南京 210009)

·论 著·

纳米银联合辐射后脑胶质瘤细胞凋亡与小胶质细胞的变化及其关系

刘培党1，2，金海振1，赵静1，唐萌2

(1.东南大学医学院 神经生物学研究所，江苏 南京 210009； 2.东南大学 江苏省生物材料与器件重点实验室，江苏 南京 210009)

目的：研究纳米银联合辐射后大鼠脑胶质瘤细胞凋亡与瘤内小胶质细胞的变化及其关系。方法：将C6细胞立体定向接种于大鼠右侧尾状核，建模后第8天将荷瘤鼠随机分成辐射对照组和纳米银联合辐射组，分别立体定向注入等体积的去离子水及20 μg的纳米银，并行单次电离辐射。应用原位末端转移酶标记(TUNEL)法和OX42免疫组织化学染色分别检测辐射后瘤组织内细胞凋亡及小胶质细胞活性的动态变化。结果：TUNEL阳性细胞数目在辐射后6 h显著增加，24 h明显减少；辐射后6 h胶质瘤内小胶质细胞开始激活，随着时间的延长活性进一步增强。辐射后6 h 和24 h，纳米银联合辐射组TUNEL阳性细胞数目和小胶质细胞活性均较辐射对照组增加，差异有统计学意义(P<0.001)。小胶质细胞活化与胶质瘤细胞凋亡的变化趋势不同，前者迟于后者。结论：纳米银联合辐射后胶质瘤细胞凋亡增加，小胶质细胞活化；激活的小胶质细胞可能没有参与胶质瘤细胞的急性凋亡过程。

纳米银； 胶质瘤； 电离辐射； 细胞凋亡； 小胶质细胞

脑胶质瘤约占全部颅内肿瘤的50%，是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤[1]。由于恶性胶质瘤具有侵袭性生长特性，手术难以完全切除，复发率高。辐射治疗是脑胶质瘤重要的治疗手段之一，但大部分胶质瘤对射线不敏感，辐射治疗效果亦不佳[2]。如何增强胶质瘤细胞的辐射敏感性，一直是临床上亟待解决的热点问题。纳米技术的出现为肿瘤的成像、诊断和治疗提供了新的有力工具。金属银纳米材料由于其独特的抗菌、催化及非线性光学等性能，使其在生物、医学等领域的研究中具有广阔的应用前景。我们先前的研究发现，纳米银颗粒能够显著提高射线对胶质瘤细胞的杀伤作用[3-4]。

大量研究表明，细胞凋亡失衡与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。更重要的是，辐射、化疗等多种抗肿瘤治疗的部分机制与诱导凋亡有关[5]。另外，作为中枢神经系统及其疾病中主要的免疫效应细胞，小胶质细胞参与许多生理和病理过程，尤其在杀伤肿瘤效应中发挥重要作用[6-7]。纳米银联合辐射后，小胶质细胞是否参与胶质瘤细胞的凋亡过程尚不清楚。本研究在建立大鼠胶质瘤脑内模型的基础上，通过立体定位向肿瘤内注入一定剂量的纳米银并进行电离辐射，观察胶质瘤细胞凋亡和小胶质细胞的动态改变，以了解其在纳米银联合辐射中的作用及关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2主要仪器 单臂数字式脑立体定向仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，电离辐射仪(德国Siemens公司)，Olympus光学显微镜(日本Olympus公司)，CM-1900冰冻切片机和Leica图像处理系统(德国Leica公司)，JEM-2000EX透射电子显微镜(TEM，日本JEOL公司)。

1.1.3动物和细胞 健康雄性Wistar大鼠24只，2～3月龄，体重220～260 g，购于东南大学动物实验中心。大鼠C6胶质瘤细胞株购于中国科学院上海生物研究所。

1.2 方法

1.2.1C6胶质瘤细胞培养 细胞在含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中传代培养至对数生长期，以不含乙二胺四乙酸二钠的质量分数为0.25%的胰酶消化，离心后去除上清液，制成细胞悬液。台盼蓝染色检测细胞活力，调整细胞浓度为1×108ml-1，置于37 ℃恒温摇床待接种。

1.2.2荷瘤鼠模型制作及动物分组 大鼠用质量分数为0.4%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，将头部固定在脑立体定向仪上，参照Paxinos-Watson大鼠图谱确定右侧纹状体移植靶点(前囟前1 mm、右旁开3 mm、硬脑膜下5 mm)。每只大鼠注入10 μl单细胞悬液，注射速度1 μl·min-1，注射完毕后留针5 min。将4只荷瘤鼠经灌注后苏木素-伊红(HE)染色，确定肿瘤分化程度；GFAP免疫组织化学染色，验证胶质瘤的性质。将其余20只荷瘤大鼠随机分为辐射对照组(瘤内注射去离子水加电离辐射)和纳米银联合辐射组(瘤内注射20 μg纳米银加电离辐射)。每组根据辐射后不同时间再分为辐射后6 h和24 h两个时间点，观察细胞凋亡和小胶质细胞活性的变化。

1.2.3纳米银瘤内注入及辐射 建模后第8天，将各辐射组荷瘤大鼠麻醉后固定于脑立体定向仪上，原切口切开头皮，寻找到原骨孔，分别抽取10 μl去离子水及等体积的纳米银悬液(20 μg，去离子水配制)立体定向注入相应瘤区。注射后24 h行6 MV电子线照射。每只动物共接受单次10 Gy照射，剂量率为200 cGy·min-1。

1.2.4组织学和免疫组织化学染色 将大鼠进行常规灌注固定，断头取脑，置于含质量分数为4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PB)后固定24 h后，入含质量分数为30%蔗糖的PB液至沉底。取瘤区所在脑组织行冠状冰冻切片，片厚10 μm。相应组瘤组织行常规HE染色。将部分切片移入体积分数为3%的过氧化氢溶液，室温下作用15 min。山羊血清封闭非特异性抗原，室温下30 min。分别滴加一抗GFAP(1∶80)、OX42(1∶50)，4 ℃孵育过夜。加入生物素标记二抗工作液，37 ℃孵育60 min，PBS清洗3次，再加入碱性磷酸酶标记链霉卵白素37 ℃反应30 min。DAB显色后，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。

1.2.5TUNEL染色 取各辐射组剩余切片，按TUNEL试剂盒说明书原位检测凋亡细胞，阴性对照为不加TDT酶。结果判定：细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞。每个标本选2张切片，计数每高倍视野中的凋亡细胞，共选6个高倍(400倍)视野，其均值为该标本的代表值。

由上述研究可知,超声辅助对于食品原料中的类黑精提取有非常大的促进作用。类比其辅助萃取时的优点,例如破坏细胞壁细胞膜,促进生物活性物质释放等,可以预测一些非热加工技术在类黑精方面的辅助提取的前景,如高静水压萃取、高压脉冲电场等。此外,超临界流体萃取等技术还有绿色、清洁,减少有机试剂使用的优点。然而,这些技术在类黑精提取方面的应用报道较少,属于较新领域。

1.2.6累积光密度的测定 累积光密度为OX42免疫组织化学染色阳性区域的每个像素点的光密度总和。累积光密度的大小反映OX42的活性变化。用Leica摄影显微镜进行图像采集，用Image pro-Plus 6.0分析图像中的累积光密度。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 纳米银的表征结果

TEM结果显示，纳米银颗粒在形态上以球形为主，分散均匀，无团聚现象(图1)。粒径统计结果显示，纳米银粒子单分散性较好，平均粒径为(10.2±1.1) nm。

图1 纳米银TEM照片

Fig 1 Image of nanosilver taken by TEM

2.2 胶质瘤组织学和GFAP免疫组织化学染色结果

脑胶质瘤HE染色结果显示，肿瘤细胞密集成群，形态多样，分化程度低，异型性高；免疫组化染色结果显示肿瘤组织内GFAP表达较弱。

2.3 TUNEL染色结果

纳米银联合辐射组胶质瘤细胞凋亡数目均比辐射对照组相应期瘤内细胞凋亡数目高(图2)。辐射后6 h，联合辐射组瘤内细胞凋亡数目与相应期的对照组比较，差异有统计学意义(P<0.001)。辐射后24 h细胞凋亡数目显著减少，但联合辐射组凋亡细胞数目仍较辐射对照组多(P<0.001)。

a 与相应期对照组相比，P<0.001

图2 纳米银联合辐射后胶质瘤细胞凋亡的变化

Fig 2 Changes in apoptosis of glioma cells following nanosilver plus radiation

2.4 小胶质细胞OX42染色结果

辐射后6 h两组动物脑胶质瘤内OX42均有表达，但阳性细胞胞体多小而圆，突起较短，胞浆浅染，纳米银联合辐射组OX42活性与辐射对照组相比差异有统计学意义(P<0.001，图3A、B，图4)。辐射后24 h OX42活性明显增强，表现为OX42阳性细胞胞体增大，胞浆染色较深，部分细胞突起粗长，联合辐射组OX42活性较辐射对照组明显增高(P<0.001，图3C、D，图4)。辐射后24 h联合辐射组可见大量OX42阳性细胞从瘤周组织向瘤区浸润。

2.5 小胶质细胞活性变化与胶质瘤细胞凋亡的关系

小胶质细胞活化与胶质瘤细胞凋亡的变化趋势不同，前者迟于后者。OX42累积光密度与胶质瘤细胞凋亡指标呈负相关(P<0.001)。

图3 纳米银联合辐射后OX42阳性细胞的变化(×400) A.辐射对照组，辐射后6 h； B.联合辐射组，辐射后6 h； C.辐射对照组，辐射后24 h； D.联合辐射组，辐射后24 h

Fig 3 Changes of OX42 positive cells following nanosilver plus radiation(×400) A.irradiated control group，6 h postirradiation; B.combined treatment group， 6 h postirradiation; C.irradiated control group，24 h postirradiation; D.combined treatment group，24 h postirradiation

a 与相应期对照组相比，P<0.001

图4 纳米银联合辐射后OX42阳性区域累积光密度的变化

Fig 4 Changes of the integrated optical densities of OX42 positive areas following nanosilver plus radiation

3 讨 论

作为星形胶质细胞的主要中间丝蛋白，GFAP常被用作识别正常或病理情况下星形胶质细胞来源组织的标志物。大量研究证实，GFAP表达强度与胶质瘤恶性程度呈负相关[8]。本实验结果显示，C6脑胶质瘤细胞GFAP反应呈弱阳性，提示肿瘤分化程度低，恶性程度高。近年来，荷C6胶质瘤大鼠已作为高度恶性多形性胶质母细胞瘤动物模型广泛用于脑胶质瘤病因学和药效学等的研究[9-10]。

凋亡又称为Ⅰ型程序性细胞死亡，是细胞死亡的机制之一。本研究结果显示，辐射后6 h胶质瘤细胞凋亡数目比辐射后24 h明显增多，这与文献报道[11-12]一致。放射线能够引起细胞凋亡，且凋亡高峰期主要发生在辐射后的最初几个小时[11-12]。辐射后6 h和24 h，纳米银联合辐射组胶质瘤细胞凋亡数目均比相应期辐射对照组高，提示纳米银辐射增敏杀伤胶质瘤细胞的部分机制可能与诱导细胞凋亡有关。

我们发现纳米银联合辐射后小胶质细胞的活化具有时程效应，其活性较辐射对照组明显增高。作为中枢神经系统中功能活跃的免疫细胞，小胶质细胞在损伤性刺激诱导的级联反应中起到重要作用[13]。首先，激活的小胶质细胞通过吞噬清除肿瘤组织，发挥杀瘤效应。其次，促使多种炎症细胞因子释放增加，如肿瘤坏死因子α、白介素1等，加重炎症反应[14]。第三，通过活化诱导型一氧化氮合酶，可以长时间地产生一氧化氮[15]。我们前期研究发现纳米银联合辐射后脑胶质瘤内一氧化氮水平显著增高[16]。过量的一氧化氮会由生理状态下的调节因子转变为细胞毒效应因子，直接或间接地促进肿瘤细胞死亡[15]。本研究观察到，小胶质细胞反应明显增强时间迟于胶质瘤细胞凋亡高峰时间，两者的变化趋势不同，提示小胶质细胞的激活可能没有参与胶质瘤细胞的急性凋亡过程。

综上所述，纳米银联合辐射能够促进胶质瘤细胞凋亡，诱导小胶质细胞活化。激活的小胶质细胞可能在纳米银联合辐射杀伤胶质瘤细胞的效应中发挥一定的作用，但可能没有参与纳米银增加辐射所诱导胶质瘤细胞的急性凋亡过程，其对胶质瘤细胞的远期命运及转归的影响有待于进一步明确。对细胞死亡方式及相关介导因素的深入研究，有助于揭示纳米银辐射增敏杀伤胶质瘤细胞的作用机制。

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Changes in apoptosis of glioma cells and microglia activity and their correlation following nanosilver plus radiation

LIU Pei-dang1，2，JIN Hai-zhen1，ZHAO Jing1，TANG Meng2

(1.InstituteofNeurobiology，SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.JiangsuKeyLaboratoryforBiomaterialsandDevices，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To study the changes in apoptosis of glioma cells and microglia activity and their correlation following nanosilver plus radiation. Methods: C6 glioma cells were stereotactically transplanted into the rat’ right caudate nucleus. 8 days after inoculation， the tumor-bearing animals were randomly divided into the irradiated control group and combined treatment group， which then received intratumoral injections of deionized water or nanosilver of the same volume(20 μg)， followed by a single dose of ionizing radiation. The dynamic changes of apoptosis and microglia activity in the tumor tissue were examined by TUNEL assay and OX42 immunohistochemical staining， respectively. Results: The number of TUNEL-positive cells increased significantly 6 h after irradiation， and then dropped significantly 24 h postirradiation. Microglia activity was expressed 6 h after the radiation， and it grew further over time. Furthermore， compared with that in the irradiated control group， the number of TUNEL-positive cells and microglia activity increased significantly in the combined treatment group 6 h and 24 h after the radiation(P<0.001).The expression trends of microglia activity and TUNEL-positive cells were different， with the former being later. Conclusion: The combination of nanosilver with radiation can promote glioma cells apoptosis and activate microglia. The activated microglia may not participate in the acute process of glioma cell apoptosis．[Key words] nanosilver； glioma； ionizing radiation； apoptosis； microglia

2015-04-15

2015-05-04

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2013CB933904，2011CB933500)

刘培党(1969-)，男，山东枣庄人，副教授，医学博士。E-mail:seulpd@163.com

刘培党，金海振，赵静，等.纳米银联合辐射后脑胶质瘤细胞凋亡与小胶质细胞的变化及其关系[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：679-683．

R739.41; R329.25

1671-6264(2015)05-0679-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.001