MICA 基因微卫星多态性与卵巢癌的关系研究

郭连英，齐 峥，王化丽，刘 刚

(1.大连医科大学 病理生理学教研室，辽宁 大连116044;2.辽宁师范大学附属中学，辽宁 大连116023;3.大连市妇产医院 妇科，辽宁 大连116033;4.大连医科大学附属第二医院，辽宁 大连116027)

卵巢癌是病死率最高的妇科生殖道恶性肿瘤。由于缺乏有效的早期诊断技术，75%以上卵巢癌患者确诊时为晚期，5年生存率不到30%。严重地威胁着女性的生命健康［1-2］。卵巢癌的发病受多种因素影响，其中遗传易感性是肿瘤发生、发展的重要因素。研究表明卵巢癌的发病是多基因的联合作用，筛选卵巢癌相关基因并对其作用进行研究有助于探讨卵巢癌发生的机理。已有报道c - myc、p53、BRCA1 和BRCA2 等基因与卵巢癌的发病密切相关［3-5］。

人类白细胞抗原(huaman leukocyte antigen，HLA)是人类的主要组织相容性复合体(MHC)，位于6 号染色体短臂上，包括一系列紧密连锁的基因座，在免疫识别及遗传控制中起到重要的作用［6］。MHC-Ⅰ类链相关基因A(MHC class I chain-related gene A，MICA)位于HLA 复合体中I 类HLA -B位点上游46 kb，与HLA -B 基因位点紧密连锁，编码跨膜区的第5 外显子具有(GCT)n 微卫星多态性［7-8］。微卫星多态性主要表现为2 ～6 个核苷酸的串联重复。国内外资料表明MICA 基因第5 外显子微卫星多态性与某些肿瘤和自身免疫病相关［9-12］。本文将首次探讨MICA 基因第5 外显子微卫星多态性与卵巢癌发病的关系，从分子水平为卵巢癌的预防和诊治提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 对 象

实验组包括95 名于2010年4月至2012年4月大连市妇产医院确诊的卵巢癌患者，平均年龄(50.25 ±10.92)岁。对照组包括同期99 名无血缘关系的辽宁汉族健康女性，平均年龄(48. 67 ±9.84)岁。

1.2 方 法

1.2.1 标本DNA 提取:外周静脉采血3 mL，EDTA抗凝。采用血液基因组DNA 提取试剂盒(北京天根生化科技公司，批号J8903)，按照试剂盒说明书操作提取标本基因组DNA。DNA 浓度调为50 ng/μL 左右，纯度A260/A280 比率在1.6 ～1.9。

1.2.2 PCR 反应:采用primer 5 软件设计MICA 基因第5 外显子引物序列，由大连宝生物公司合成。MICA 基因的引物序列为上游:5’-CCTTTTTTTCAGGGAAAGTGC-3’，上游引物5’标记荧光FAM，下游:5’-CCTTACCATCTCCAGAAACTGC-3’。20 μL PCR反应体系包括:2 μL 10 ×PCR 缓冲液，0.25 mmol/L dNTPs，0.5 μmol/L 引物，100 ng 基因组DNA 和1U Taq DNA 聚合酶。反应在PCR 扩增仪ABI9700 上进行，反应条件为95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，60℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环;72 ℃延伸10 min，最后置于4 ℃终止反应。

1.2.3 毛细管电泳:荧光标记PCR 产物在ABI 310型遗传分析仪上进行毛细管电泳。Collection 软件收集信息，GeneScan Analysis 3.1 软件进行基因分型。

1.3 统计学方法

Hardy-Weinberg 平衡的吻合性检验，等位基因频率分析均使用Arlequin 3. 11 软件计算。使用SPSS15.0 软件进行χ2检验分析。P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡

实验组和对照组基因型分布均符合Hardy -Weinberg 平衡(P ＞0.05)。

2.2 实验组和对照组MICA 基因第5 外显子微卫星多态性分布

两组均检测出5 种等位基因片段，分别为A4(179 bp)、A5(182 bp)、A5.1(183 bp)、A6(185 bp)和A9(194 bp)。两组MICA 基因第5 外显子等位基因频率分布见表1。正常对照组MICA 第5 外显子A5.1等位基因的频率最高，为33.8%。实验组和对照组MICA 第5 外显子A5 等位基因的频率分别为31.1%和19.2%，差异有显著性意义(P ＜0.01)，其他等位基因频率分布差异均无显著性意义(P ＞0.05)。

表1 实验组和对照组MICA 基因第5 外显子等位基因频率分布的比较Tab 1 Differences in allelic distributions of MICA gene polymorphism between patients and controls

3 讨 论

HLA 基因位于人的第6 号染色体短臂，是人体内最复杂的遗传多态性系统，也是机体内特异性免疫识别和免疫应答的主要成分［6］。MICA 距HLA -B 位点最近，全长11.7 kbp，整个基因包括6 个外显子，其中第5 外显子编码跨膜区，有1 个(GCT)三核苷酸重复序列的微卫星多态位点［7］。微卫星是一类广泛存在于各类真核生物基因组中的由1 ～6 bp串联重复排列而成的DNA 顺序，又被称为短的串联重复顺序(STR)，其高度多态性源于串联重复拷贝数目在同种不同个体间的差别［13］。由于微卫星标记多态性高、重复性好，因此在基因的定位、人类疾病诊断及预测、亲权分析、进化研究等领域中都有着重要的应用价值。

目前，MICA 基因第5 外显子已发现A4(179 bp)、A5(182 bp)、A5.1(183 bp)、A6(185 bp)和A9(194 bp)共5 种等位基因片段，其中A5.1 是在A5的基础上插入一个碱基G，而导致移码突变。国内外资料表明MICA 基因第5 外显子微卫星多态性与头颈鳞状细胞癌、乳腺癌等肿瘤和糖尿病等自身免疫病相关［9-12］。本研究结果表明MICA 基因第5 外显子微卫星多态性与卵巢癌的发病相关，A5 等位基因增加了卵巢癌的发病风险。

研究表明MICA 基因第5 外显子微卫星多态性分布在不同群体间存在种族差异［14-15］。1997年Ota 等［15］首先对9 个群体进行了MICA 第5 外显子微卫星多态性研究，其中中国回族、哈萨克斯坦和日本群体中最常见的等位基因为A5，维吾尔族、伊朗和意大利等群体以A6 最为常见。MICA 基因第5外显子微卫星多态性分布在中国汉族人群中存在地区差异［16-19］。中国南方上海、湖北、成都和云南地区汉族人群MICA 第5 外显子的等位基因均以A5为主，其次为A5.1［16-18］。中国北方辽宁汉族人群MICA 第5 外显子的等位基因均以A5.1 为主，其次为A5［19］。本文结果与范亚欣等［19］结果相同，辽宁地区汉族人群A5.1 最为常见(33.8%)，其次为A5(19.2%)。人类疾病均直接或间接与遗传有关。不同人群的遗传背景不同，他们对某些疾病的遗传易感性也不同。林健［12］报道I 型糖尿病(T1DM)是一种具有多基因遗传背景的自身免疫性疾病，MICA基因遗传多态性与T1DM 发病和进展缓急相关，但在不同的种族其易感性和保护性基因型不完全一致，并且这种作用是独立于其他T1DM 易感基因如人类白细胞抗原(HLA)DR/DQ。其他地区或种族人群MICA 基因第5 外显子微卫星多态性与卵巢癌的相关性研究还需进一步探索。

MICA 微卫星多态性与某些肿瘤相关，可能与它们和HLA 经典的I、II 类位点的连锁不平衡有关［10-11］。文献报道西班牙乳腺癌患者MICA -A5.1与HLA-B7 单倍型的频率显著高于健康对照组［11］。MICA 和HLA 其他位点的单倍型与卵巢癌的关系也需要深入的探讨。

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