儿童狼疮性肾炎患者中EB病毒潜伏膜蛋白1的表达

丁 艳，廖 旺，向 伟，杨慧兰，何小解，党西强，易著文

儿童狼疮性肾炎患者中EB病毒潜伏膜蛋白1的表达

丁 艳1，2，廖 旺1，向 伟2，杨慧兰3，何小解4，党西强4，易著文4

摘要目的 通过实时定量逆转录PCR（RT-PCR）、肾脏免疫组化和ELISA 3种方法研究儿童狼疮性肾炎（LN）中EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白1（LMP-1）的表达，试图探讨LMP-1在儿童LN中的致病机制。方法 41例LN患儿和12例健康对照组，分别用RT-PCR法、免疫组化法、ELISA法检测两组外周血单核细胞（PBMCs）、肾脏组织及血清中LMP-1的表达。结果 ①RT-PCR法、免疫组化法、ELISA法检测LN患儿和健康对照者的阳性率分别为65.9%vs 8.3%，95.1% vs 16.7%，22.0%vs 8.3%，差异有统计学意义（P＜0.05）；②3种方法检测LMP-1的表达，免疫组化法检测阳性率高于其他两种方法，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 儿童LN中存在EBV潜伏期基因LMP-1表达异常，其中肾脏组织中表达阳性率最高，提示LMP-1可能参与了儿童LN的发病。

关键词儿童；狼疮性肾炎；潜伏膜蛋白1；EB病毒

2015-02-02接收

作者单位：1海南省人民医院皮肤科，海口 570102

2海南省妇幼保健院皮肤科，海口 570206

3广州军区广州总医院皮肤科，广州 510010

4中南大学湘雅二医院儿童医学中心小儿肾脏专科，长沙410011

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是累及全身多系统的自身免疫性疾病，表现为T、B淋巴细胞异常活化和大量自身抗体产生［1］。儿童SLE通常临床表现较严重，起病时急而重，是儿童时期预后较差的一种疾病。SLE患者几乎100%肾活检发现有肾脏受累，其中45%～85%有肾损害临床表现，儿童狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）比成人更普遍、更严重［2-3］。近年来EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染与SLE发生发展的关系已成为SLE研究的热点［4-5］。EBV具有嗜B淋巴细胞的特性，可终生潜伏于B淋巴细胞，对机体免疫系统造成持续和慢性刺激。EBV基因编码的抗原和SLE患者的自身抗原有较高的同源性，有诱发自身免疫的可能［5］。该研究通过实时定量逆转录PCR（RTPCR）、肾脏免疫组化和ELISA 3种方法研究儿童LN中EBV潜伏期基因之潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP-1）的表达，试图探讨LMP-1在儿童LN中的致病机制。

1　材料与方法

1.1 病例资料 实验组来源于海南省妇幼保健院皮肤科与中南大学湘雅二医院儿童医学中心小儿肾脏专科，选取了2009年1月～2013年11月收治的LN患儿41例，其中女30例，男11例；年龄6～16 （11.1±2.4）岁。SLE的诊断依据为1982年美国风湿病协会修正的诊断标准［6］，诊断为SLE基础上行肾穿刺活检确诊为LN。12例健康对照组肾脏组织及静脉血均来自海南省妇幼保健院小儿外科急诊创伤的患儿，患儿及患儿家族中无自身免疫性疾病史。其中女8例，男4例，年龄7～17（12.3±3.3）岁。实验组和对照组的年龄经t检验显示差异无统计学意义，性别构成比比较采用χ2检验，两组间差异无统计学意义。本研究通过海南省妇幼保健院和中南大学湘雅二医院伦理委员会的批准，每个患儿家属均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法检测LMP-1基因的表达 细胞分离及RNA提取：抽取LN患儿及健康对照组肝素抗凝静脉血10 ml。用淋巴细胞分离液常规分离外周血单核细胞（PBMCs），用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取RNA。cDNA合成采用逆转录试剂盒（美国Fermentans公司），反应体系：1～5 μg RNA，5×Reaction Buffer 5 μl，2.5 U／μl Poly A Polymerase 1 μl，RT Mix 1 μl，总体积25 μl，37℃反应1 h，85℃5 min。实时PCR：采用Icycler IQ实时荧光定量PCR仪（美国Bio-rad公司）检测EBV基因LMP1的表达。引物序列由上海博亚生物技术有限公司合成，LMP1上游引物：5’-TTGGTGTACTCCTACTGATGATCACC-3’，下游引物：5’-AGTAGATCCAGATACCTAAGACAAGT-3’；PCR反应体

积为20 μl，反应体系为2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl，（10 μmol／L）上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，无酶水7 μl。PCR反应条件为：95℃预变性3 min，之后每一步95℃变性10 s，引物58℃退火延伸30 s，共进行35个循环。采用标准曲线相对定量法进行结果分析。

1.2.2 免疫组化法检测肾脏组织中LMP-1的表达

肾脏组织块经固定、石蜡包埋、脱蜡、水化及高温高压抗原修复等前期处理后，PBS缓冲液洗片3次，滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育10～15 min。滴加一抗（此实验中一抗无需稀释）100 μl，置于湿盒内，4℃过夜。滴加生物素标记羊抗鼠二抗工作液，室温孵育10～15 min。滴加HRP标记链霉亲和素，室温孵育10～15 min。PBS漂洗后DAB显色，在显微镜下观察染色程度；苏木精复染（30 s～2 min），1%盐酸酒精分化（1 s）；自来水冲洗10～15 min；烘干后中性树胶封片，镜检。在均一条件下随机选取切片的5个视野拍照（×200）。

1.2.3 ELISA法检测血清中LMP-1抗体的水平ELISA试剂盒购于上海蓝基公司，严格按照说明书操作。结果判定：置酶标450 nm波长处测定样本吸光度（optical density，OD）值，根据标准品制定的标准曲线换算出各样本浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行分析。计数阳性率使用百分比表示，计数资料比较采用χ2检验或使用Fisher精确概率法。

2　结果

2.1 RT-PCR法检测LMP-1基因的表达 RTPCR法检测41例LN患儿和12例健康对照者，发现27例（65.9%）患儿和1例（8.3%）健康对照者PBMCs中LMP-1基因表达呈阳性，LN患儿的LMP-1基因表达的阳性率与健康对照者相比，差异有统计学意义（χ2＝10.12，P＜0.05）。见图1。

2.2 免疫组化法检测LN患儿肾脏组织中LMP-1的表达 41例LN患儿和12例健康对照者肾脏组织中LMP-1蛋白表达结果如下：39例（95.1%）LN患儿和2例（16.7%）健康对照者表达呈阳性，LN患儿肾脏的LMP-1表达的阳性率与健康对照者相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 ELISA法检测血清中LMP-1蛋白水平 41 例LN患儿和12例健康对照者血清中LMP-1抗体的表达结果如下：9例（22.0%）LN患儿和1例（8.3%）健康对照者呈阳性表达，LN患儿血清的LMP-1抗体表达的阳性率与健康对照者相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 3种方法检测LN患儿LMP-1表达阳性率的比较 3种方法检测LN患儿EBV潜伏期基因LMP-1的表达，其检出阳性率比较差异有统计学意义（χ2＝26.971，P＝0.000）：免疫组化法和ELISA法的检出阳性率比较，差异有统计学意义（χ2＝42.260，P＜0.001），免疫组化法和RT-PCR法的检出阳性率比较，差异有统计学意义（χ2＝9.400，P＝0.002）。见表1。

表1　不同检测方法检测41例LN患儿LMP-1情况比较

3　讨论

国内外的大量研究［4-5］表明，SLE患者中EBV血清学阳性率、病毒载量及EBV基因的表达都显著高于健康对照者，提示EBV在SLE的发病中起着重要的作用。EBV在感染B淋巴细胞后，表达多种潜

伏蛋白，LMP-1是其中一种，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是一种跨膜蛋白，通过激活相关信号传导通路介导细胞异常生物学行为。LMP1提供替代B细胞的存活和分化的信号［5］。国外的研究［7-8］表明，LMP-1能够通过多种机制加重SLE的自身反应性，包括直接激活B细胞，增强B细胞活化的协同刺激信号，刺激B细胞活化因子（BAFF）的产生，能够协助打破自我耐受等［9］。本研究通过RT-PCR、免疫组化法和ELISA法检测均发现儿童LN的LMP-1的表达显著增加，提示LMP-1在儿童LN中可能起到重要的致病作用。

James et al［10］发现99%的SLE患者为EBV血清学阳性，Yu et al［11］报道SLE患者外周血中有81.6%为EBV DNA阳性，而健康对照者只有48.9%阳性，本研究显示使用ELISA法检测LN患儿血清中LMP-1蛋白的表达，仅有22%的阳性率，RTPCR法检测LN患儿血液中LMP-1基因表达，仅有65.9%的阳性率，均低于国外的研究。考虑可能原因是：①国外EBV血清学研究是针对EBV壳抗原（VCA）的抗体研究，存在敏感性高但特异性较低的问题。②本实验是针对LMP-1 DNA的特异性检测，故检出率较国外EBV DNA检测阳性率低。

本实验41例LN患儿肾脏组织免疫组化检测结果显示95.1%的患儿有LMP-1的表达，较Yu et al［12］报道的阳性率（58.6%）高，可能与本实验均为LN儿童患者，儿童的EBV感染率较成人更高、更容易累及肾脏有关。

3种方法检测LN患儿LMP-1的表达，肾脏组织免疫组化阳性率最高，较其它两种方法有显著性差异，提示EBV感染表达的LMP-1可能与儿童LN的肾脏病变有重要关系，肾脏组织免疫组化可能成为诊断EBV相关性LN的重要手段，而ELISA法及RT-PCR法检测血液中LMP-1的表达可能成为预示LN的诊断方法。

参考文献

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The expression of LMP-1 gene in juvenile lupus nephritis

Ding Yan1，2，Liao Wang1，Xiang Wei2，et al
（1Dept of Dermatology，Hainan General Hospital，Haikou 570102，2Dept of Dermatology，Maternal and Child Health Care Hospital of Hainan Province，Haikou 570206）

AbstractObjective To discuss the role of latent membrane protein 1（LMP-1）in the pathgenesis of juvenile lupus nephritis（LN）through investigating expression of LMP-1 by RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA.

Methods RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA were applied to detect expression of LMP-1 in PBMCs，kid-

ney tissue and serum from 20 patients with LN and 12 healthy control subjects respectively.Results ①There was signifcant difference between juvenile LN patients and healthy controls by RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA，Positive rate were 65.9%vs 8.3%，95.1%vs 16.7%，22.0%vs 8.3%，respectively（P＜0.05）.②Positive rates of LMP-1 in juvenile LN were significantly different among three methods and the positive rate detected by immunohistochemistry was higher than the other two methods（P＜0.05）.Conclusion The results demonstrate that there are aberrant expression of LMP-1 gene in juvenile LN，thepositive rate of LMP-1 in kidney tissue is highest，suggesting that LMP-1 gene may contribute to the pathgenesis of juvenile LN.

Key wordsjuvenile；lupus nephritis；latent membrane protein 1；Epstein-Barr virus

作者简介：丁 艳，女，博士研究生；何小解，男，副教授，硕士生导师，责任作者：E-mail：hexj7150＠163.com；向 伟，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：xiangwei8＠163.com

基金项目：海南省自然科学基金（编号：814314、309079）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0676-04

中图分类号R 373.9；R 758.69