云南不同地区臭灵丹提取物的抗氧化活性

郝志云 ， 杨新周 ， 林惠昆， 高杨秋

(德宏师范高等专科学校 理工系， 云南 德宏 678400)



云南不同地区臭灵丹提取物的抗氧化活性

郝志云 ， 杨新周 ， 林惠昆， 高杨秋

(德宏师范高等专科学校 理工系， 云南 德宏 678400)

为综合利用臭灵丹，以乙醇、甲醇、丙酮为萃取溶剂，超声波提取制备提取物，考察云南13个样点臭灵丹提取物对DPPH自由基活性的清除能力，并将其与多种抗氧化剂进行比较。结果表明：13个样点臭灵丹甲醇提取物C1～C13的IC50分别为0.175 3 mg/mL,0.195 3 mg/mL,0.099 40 mg/mL,0.084 74 mg/mL,0.110 7 mg/mL,0.124 6 mg/mL,0.504 6 mg/mL,0.291 5 mg/mL,0.118 1 mg/mL,0.056 35 mg/mL,1.020 mg/mL,0.213 3 mg/mL,0.151 9 mg/mL;乙醇提取物C1～C13的IC50分别为0.652 8 mg/mL,0.463 7 mg/mL,0.209 5 mg/mL,0.225 8 mg/mL,0.354 7 mg/mL,0.395 7 mg/mL,0.849 2 mg/mL,0.852 0 mg/mL,0.358 5 mg/mL,0.143 6 mg/mL,2.580 6 mg/mL,0.724 2 mg/mL,0.455 6 mg/mL;丙酮提取物C1～C13的IC50分别为1.908 9 mg/mL,1.622 9 mg/mL,1.222 3 mg/mL,0.583 7 mg/mL,1.474 9 mg/mL,1.081 7 mg/mL,2.839 7 mg/mL,3.318 8 mg/mL,1.024 0 mg/mL,0.449 9 mg/mL,4.919 5 mg/mL,2.308 5 mg/mL,1.497 5 mg/mL;芦丁、没食子酸、咖啡酸、香草酸和对香豆酸溶液的IC50分别为0.004 3 mg/mL,0.000 92 mg/mL,0.003 3 mg/mL,0.547 1 mg/mL,2.27 mg/mL；与5种标准品的抗氧化能力相比，依次为没食子酸>咖啡酸>芦丁>甲醇提取物>乙醇提取物>丙酮提取物，云南省13个地方臭灵丹甲醇提取物抗氧化能力(除样品11)均大于标准品对香豆酸、香草酸；样品C2、C3、C4、C5、C6、C9、C10、C13乙醇提取物抗氧化能力均大于香草酸、对香豆酸，丙酮提取物抗氧化能力(除样品11、12外)均大于香草酸。

臭灵丹； 抗氧化活性； DPPH自由基； 抗氧化剂； 云南

传统中药臭灵丹为菊科植物翼齿六棱菊[Laggerapterodonta(DC.) Benth]的干燥地上部分，别名狮子草、臭叶子、六棱菊等，主要分布于我国长江流域以南及西南部，主产于云南。民间多作为单方治疗感冒。现代药理研究表明，臭灵丹具有镇痛作用，对幽门螺杆菌有抑制作用、还具有抗炎[3]、抗肿瘤[4，5]、祛痰[6]和抗病原微生物[7-8]等作用。目前，对臭灵丹研究较多的是其黄酮类化合物的鉴别及分离、个别黄酮类化合物的抗氧化活性、臭灵丹中金属元素的含量、臭灵丹中总黄酮含量[1-9]。目前对于臭灵丹的抗氧化活性方面的报道甚少，针对云南是臭灵丹的主要产地，研究云南不同地区臭灵丹的抗氧化活性具有一定的代表性。臭灵丹在云南是一种常见的中草药，但是随着环境的恶化，数量逐年减少，笔者比较云南不同地区臭灵丹不同提取溶剂提取物的抗氧化活性，研究出抗氧化活性最好的提取物，为从云南不同地区臭灵丹中分离出抗氧化活性物质并开发天然抗氧剂提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 药材

臭灵丹(Laggerapterodonta)药材采于2013年9-10月，经德宏师专林惠昆副教授鉴定为原植物样品。所采集的样品见表1. 臭灵丹药材经过晾干，粉碎，过筛备用。

1.2 仪器与试剂

V-1100型可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，超声波(SK2200H，上海科导超声仪器有限公司)，电子天平(AR224CN，奥豪斯上海仪器公司)，电热真空干燥箱ZK-82J型(上海崇明实验仪器厂)，旋转蒸发仪(EYELAN-1100，上海耀裕仪器设备有限公司)。

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,纯度>99.0%，国药集团化学试剂有限公司)，槲皮素、山奈酚、咖啡酸、芦丁、没食子酸、对香豆酸(购自国药集团浙江华东医药有限公司，纯度>98%)，乙醇、甲醇、丙酮等试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。

1.3 DPPH储备液的制备

精确称取DPPH 10 mg，用无水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，得浓度为DPPH 0.1 mg/mL的储备溶液。用时稀释成浓度为0.024 mg/mL的标准溶液。

表1 臭灵丹样品的采集信息

1.4 臭灵丹提取物的制备

乙醇提取物的制备：精确称取2.000 0 g臭灵丹样品于100 mL的锥形瓶中，加入20 mL无水乙醇溶液，封口，超声提取45 min后，过滤，滤渣重复提取2次。合并3次滤液，经旋转蒸发仪浓缩，定容至25 mL，备用。同法制备臭灵丹甲醇提取物、丙酮提取物。

据了解，液空中国将于2020年底前在中国持续推广“SIO前瞻”项目，并且不断引入液空在其他国家实施的成功经验。同时，为了顺应“SIO前瞻”项目的实施，DPC也会在未来几年完成两方面的重要转型：一是随着集中运行项目的实施，DPC将通过安全、可靠、高效的方式，负责大范围内集中化运行的管理和执行；二是通过运用更先进的大数据分析技术和新型数字化工具，实现更智能、更全面和更快速的决策制定，持续向“卓越运行”迈进。

1.5 清除DPPH自由基能力的测定

准确移取DPPH标准溶液4.5 mL，依次加入一定体积的提取物溶液于10 mL比色管中，定容至5 mL，置于暗处30 min，在波长517 nm下测定空白DPPH的吸光度值A空白和加入提取物后DPPH的吸光度值为A样品，按下式计算自由基清除率(%)[10]。

清除率=(A空白-A样品)/A空白×100%

2 结果与分析

2.1 臭灵丹不同提取物对DPPH的清除率

2.1.1 乙醇提取物 由图1和表2可知，臭灵丹乙醇提取物浓度与清除率呈线性关系。抗氧化能力用IC50大小来表示，IC50越小抗氧化能力越强，根据不同地区臭灵丹清除DPPH自由基IC50不同，得出不同地区臭灵丹样品乙醇提取物抗氧化能力依次为C10>C3>C4>C5>C9>C6>C13>C2>C1>C12>C7>C8>C11。试验发现，C11样品抗氧化能力较差，可能是因为在采摘过程中，样品C11被大雨淋并浸泡过，其抗氧化物质随雨水流失。

图1 云南不同地区臭灵丹乙醇提取物 的DPPH清除率

Fig.1 DPPH scavenging rate of ethanol extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

表2 云南不同地区臭灵丹乙醇提取物清除DPPH 的回归方程及IC50值

Table 2 Regression equations and IC50value of DPPH scavenging rate of ethanol extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

样品Samples回归方程RegressionequationR2IC50/(mg/mL)C1y=70.454x+4.0040.99910.6528C2y=76.726x+14.410.97960.4637C3y=127.84x+23.2140.98120.2095C4y=168.47x+11.9670.95370.2258C5y=118.12x+8.11920.99270.3547C6y=115.43x+4.33970.99920.3957C7y=53.281x+4.75130.99130.8492C8y=42.07x+14.1550.99180.8520C9y=121.98x+6.27150.99510.3585C10y=228.75x+17.1530.98060.1436C11y=16.516x+7.37940.99532.5806C12y=61.06x+5.78120.99310.7242C13y=85.821x+10.8960.99170.4556

图2 云南不同地区臭灵丹甲醇提取物的DPPH清除率

Fig.2 DPPH scavenging rate of methyl extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

2.1.2 甲醇提取物 根据图2和表3可知，臭灵丹甲醇提取物浓度与清除率呈线性关系，不同地区臭灵丹样品甲醇提取物抗氧化能力依次为C10>C4>C3>C5>C9>C6>C13>C1>C2>C12>C8>C7>C11。

表3 云南不同地区臭灵丹甲醇提取物清除DPPH 的回归方程及IC50值

Table 3 Regression equations and IC50value of DPPH scavenging rate of methyll extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

样品Samples回归方程RegressionequationR2IC50/(mg/mL)C1y=273.71x+2.02580.98130.1753C2y=247.12x+1.74080.99380.1953C3y=437.85x+6.4620.99320.09940C4y=563.55x+2.24720.99810.08474C5y=465.76x-1.58020.99440.1107C6y=379.87x+2.66940.99890.1246C7y=88.376x+5.40510.99530.5046C8y=141.59x+8.71990.99670.2915C9y=390.61x+3.88490.99690.1181C10y=730.67x+8.82490.99220.05635C11y=37.237x+12.0110.99271.020C12y=217.49x+3.60280.99720.2133C13y=306.96x+3.35480.99420.1519

图3 云南不同地区臭灵丹丙酮提取物的DPPH清除率

Fig.3 DPPH scavenging rate of acetone extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

2.1.3 丙酮提取物 根据图3和表4中的数据可知，臭灵丹丙酮提取物在一定的浓度范围内与清除率呈一定的线性关系，不同地区臭灵丹样品丙酮提取物抗氧化能力依次为C10>C4>C9>C6>C3>C5>C13>C2>C1>C12>C7>C8>C11。

通过试验，得出芦丁、没食子酸、咖啡酸、香草酸和对香豆酸溶液的IC50分别为0.004 3 mg/mL、0.000 92 mg/mL、0.003 3 mg/mL、0.547 1 mg/mL和2.27 mg/mL，几种标准品抗氧化能力顺序为对香豆酸<香草酸<芦丁<咖啡酸<没食子酸。

表4 臭灵丹丙酮提取物清除DPPH的回归方程 及IC50值

Table 4 Regression equations and IC50value of DPPH scavenging rate of acetone extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

样品Samples回归方程RegressionequationR2IC50/(mg/mL)C1y=22.711x+6.64950.98151.9089C2y=29.129x+2.72680.96601.6229C3y=38.365x+3.09410.99551.2223C4y=74.845x+6.31160.99330.5837C5y=30.074x+5.6430.99061.4749C6y=40.939x+5.71720.99211.0817C7y=15.938x+4.7410.99062.8397C8y=13.637x+6.25670.99313.3188C9y=46.951x+1.9220.99451.0240C10y=100.91x+4.59740.9920.4499C11y=8.1013x+10.1450.99134.9195C12y=15.175x+14.9690.98352.3085C13y=27.776x+8.40610.99071.4975

图4 不同地区臭灵丹样品不同提取物清除DPPH的IC50

Fig.4 IC50of DPPH scavenging rate of different extracts from Laggera pterodonta of different regions in Yunnan

2.3 不同地区臭灵丹样品不同提取物清除DPPH自由基活性比较

从图4可知，13个不同地区臭灵丹样品乙醇、甲醇、丙酮提取物清除DPPH自由基活性的能力依次为甲醇提取物>乙醇提取物>丙酮提取物，说明甲醇提取物中的抗氧化成分优于乙醇提取物和丙酮提取物。

3 结论

1) 以超声提取为提取方法，乙醇、甲醇、丙酮为溶剂制备云南省13个不同地区臭灵丹提取物，并测定其清除DPPH自由基的活性能力。结果表明，不同地区臭灵丹样品的乙醇、甲醇、丙酮提取物抗氧化能力有一定的差异，其中C10样品即楚雄双柏产臭灵丹活性最强，C4样品玉溪产臭灵丹次之，这可能是由于每个地方的臭灵丹生长的环境差异(海拔、土壤、气候、降雨量等)导致，环境不一样臭灵丹中抗氧化物质的含量及种类存在差异，从而导致各地方不同的溶剂提取物之间出现显著差异。

2) 云南省13个不同地区臭灵丹样品乙醇、甲醇、丙酮提取物清除DPPH自由基活性的能力依次为甲醇提取物>乙醇提取物>丙酮提取物，出现该现象的原因可能是甲醇提取物中含有大量的黄酮类化合物及抗氧化活性物质，致使甲醇提取物的抗氧化活性最强。如果要分离抗氧化活性物质及开发天然抗氧化剂，建议首选甲醇提取物。

3) 根据几种标准品的抗氧化能力，云南省13个地区甲醇提取物抗氧化能力(除样品11)均大于标准品对香豆酸，香草酸；样品C2、C3、C4、C5、C6、C9、C10、C13乙醇提取物抗氧化能力均大于香草酸、对香豆酸，丙酮提取物抗氧化能力(除样品11、12外)均大于香草酸，总体上，丙酮提取物抗氧化能力较弱。

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(责任编辑： 孙小岚)

A scavenging Antioxidant Activity ofLaggerapterodontaExtracts from Different regions in Yunnan

HAO Zhiyun, YANG Xinzhou, LIN Huikun, GAO Yangqiu

(DepartmentofScienceandEngineering,DehongTeachers’College,Dehong,Yunnan678400,China)

The scavenging DPPH free radical capacity of different extracts from 13 Laggera pterodonta samples by three different extracting solvents of alcohol, methanol and acetone was analyzed and the antioxidant activity of Laggera pterodonta extracts was compared with other antioxidants to utilize Laggera pterodonta comprehensively. IC50of C1～C13 methanol extracts is 0.175 3 mg/mL, 0.195 3 mg/mL, 0.099 40 mg/mL, 0.084 74 mg/mL, 0.110 7 mg/mL, 0.124 6 mg/mL, 0.504 6 mg/mL, 0.291 5 mg/mL, 0.118 1 mg/mL, 0.056 35 mg/mL, 1.020 mg/mL, 0.213 3 mg/mL and 0.151 9 mg/mL respectively. IC50of C1～C13 alcohol extracts is 0.652 8 mg/mL, 0.463 7 mg/mL, 0.209 5 mg/mL, 0.225 8 mg/mL, 0.354 7 mg/mL, 0.395 7 mg/mL, 0.849 2 mg/mL, 0.852 0 mg/mL, 0.358 5 mg/mL, 0.143 6 mg/mL, 2.580 6 mg/mL, 0.724 2 mg/mL and 0.455 6 mg/mL separately. IC50of C1～C13 acetone extracts is 1.908 9 mg/mL, 1.622 9 mg/mL, 1.222 3 mg/mL, 0.583 7 mg/mL, 1.474 9 mg/mL, 1.081 7 mg/mL, 2.839 7 mg/mL, 3.318 8 mg/mL, 1.024 0 mg/mL, 0.449 9 mg/mL, 4.919 5 mg/mL, 2.308 5 mg/mL and 1.497 5 mg/mL respectively. IC50of rutin, gallic acid, caffeic acid, vanillic acid and p-coumaric acid (five standards) is 0.004 3 mg/mL, 0.000 92 mg/mL, 0.003 3 mg/mL, 0.547 1 mg/mL and 2.27 mg/mL separately. The antioxidant capacity of five standards and three extracts is gallic acid>caffeic acid >rutin>methanol extract>alcohol extract>acetone extract. The antioxidant capacity of 13 methanol extracts is higher than vanillic acid and p-coumaric acid. The antioxidant capacity of C2, C3, C4, C5, C6, C9, C10 and C13 alcohol extracts is higher than vanillic acid and p-coumaric acid.The antioxidant capacity of 10 acetone extracts is higher than vanillic acid.

Laggera pterodonta; antioxidant activity; DPPH free radical; antioxidant; Yunnan

2014-09-10； 2015-04-29修回

德宏师范高等专科学校校级科学研究项目“臭灵丹红外指纹图谱及抗氧化活性研究”(DSK201404)

郝志云(1960-)，男，副教授，从事分析化学及化学的教学与研究。 E-mail: YXZ1149@126.com

1001-3601(2015)05-0238-0065-04

R285.5

A