禽6型副粘病毒V蛋白对抗宿主细胞干扰素β的产生

田志革， 柴洪亮， 华育平

(东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨 150040)



禽6型副粘病毒V蛋白对抗宿主细胞干扰素β的产生

田志革， 柴洪亮， 华育平*

(东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨 150040)

[目的] 研究禽6型副粘病毒V蛋白对抗宿主细胞干扰素β的产生的机制。[方法] 构建真核表达禽6型副粘病毒P、V、W蛋白的重组载体，分别与IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc、AP-1-luc报告质粒共转染HEK-293T细胞，接种仙台病毒刺激细胞后，测定细胞内萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。[结果]禽6型副粘病毒V蛋白能通过降低NF-κB的活性，进而显著抑制宿主细胞产生IFN-β。[结论]该研究初步阐明了禽6型副粘病毒V蛋白对抗宿主天然免疫的机制。

副粘病毒；V蛋白；对抗；干扰素β

当病毒侵染宿主时，会遭受多种来自宿主的抗病毒反应，其中干扰素(IFN)反应在早期的天然免疫及调节获得性免疫反应时发挥重要的作用[1-3]。大量研究表明，大部分副粘病毒编码特殊的附件蛋白，即由P基因编辑剪接产生的V或/和C蛋白，通过阻断IFN传导信号或限制宿主IFN的产生来规避IFN系统[4-9]。例如，副粘病毒科的腮腺炎病毒属成员5型猿猴病毒(SV5)通过降解STAT1来阻断IFN的信号传导，仙台病毒(SeV)的C蛋白发挥相似的功能。SV5及SeV的V蛋白能降低干扰素调节因子IRF-3和NF-κB的活性，从而抑制IFN-β的产生[10-11]。

副粘病毒P基因除了表达P蛋白外，还通过编辑剪接表达V蛋白及W蛋白。为了阐明禽6型副粘病毒对抗宿主细胞先天免疫的机制，笔者将表达P、V和W蛋白的重组质粒与一系列报告质粒共转染293T细胞，通过测定荧光素酶活性来判断病毒蛋白对IFN-β基因的启动子序列的作用机制，从而对抗宿主细胞先天免疫。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1质粒与细胞。重组质粒pCDNA-P(flag标签)、pCDNA-V(flag标签)、pCDNA-W(flag标签)由笔者构建；IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc、AP-1-luc双荧光素酶报告质粒均由东北农业大学生命科学学院胡晓亮博士惠赠；HEK-293T细胞由哈尔滨兽医研究所国家重点实验室马病团队提供。

1.1.2主要试剂。Flag鼠源单抗和脂质体Lipofectamine 2000均购自Invitrogen公司；DMEM培养基购自Hyclone公司；DyLight800标记的羊抗鼠IgG抗体购自KPL公司；双荧光素酶报告分析系统试剂盒购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1转染试验。将HEK-293T细胞均匀铺于24孔板中，待细胞长成单层且密度达到80%左右时进行转染。转染体系中的共同成分为：300 μl DMEM、3 μl脂质体、60 ng RL-TK质粒；另依据试验目的不同，分别向体系中加入0.6 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc或AP-1-luc报告质粒，每个试验重复3次，同时设置转染空载体的空白对照。转染24 h后，每孔加入100 HAU的SeV进行刺激，同时设置不加病毒刺激的空白对照。病毒刺激12 h后，弃去细胞培养液，用细胞裂解液裂解细胞，离心后弃去细胞碎片，裂解获得的上清液用于免疫印迹分析及荧光素酶活性测定试验。

1.2.2免疫印迹分析。裂解上清液与5×Loading buffer按照4∶1的比例混合，在沸水浴中煮10 min，样品进行蛋白电泳后，转印至纤维素膜，进行常规免疫印迹分析。其中，一抗使用flag鼠源单抗，二抗使用羊抗鼠IgG抗体,β-actin作为内参蛋白。

1.2.3荧光素酶活性的测定。取裂解上清液20 μl，使用双荧光素酶报告分析系统试剂盒测定其活性。

2 结果与分析

为了验证表达的蛋白能否抑制IFN-β启动子的活性，在不同蛋白表达的情况下测定IFN-β-luc报告基因的双荧光素酶活性水平，当SeV感染293T细胞时，IFN-β-luc的酶活性是未染毒空白对照的50倍左右，在表达蛋白P及W蛋白时酶活性并未被抑制；在V蛋白表达后，酶活性被显著抑制(图1)，表明APMV6的V蛋白能够抑制IFN-β启动子的活性。为了阐明V蛋白发挥作用的区域，将表达V蛋白的质粒与NF-κB-luc、PRDⅢ/I-luc、AP-1-luc的质粒共转染293T细胞，在SeV刺激条件下测定双荧光素酶活性。结果表明，V蛋白能显著抑制NF-κB启动子活性(图2)，对PRDⅢ/I(图3)和AP-1(图4)启动子也有抑制作用，但不如对NF-κB启动子的抑制效果明显。免疫印迹分析(Western blot)试验表明，重组蛋白能够在293T细胞中表达，β-actin作为内参蛋白，表明细胞数目之间并无差异(图1～4)。

3 讨论

目前，病毒对抗宿主先天免疫的机制研究已成为热点，具有对抗功能的蛋白及对抗机制被不断发现。关于禽6型副粘病毒分离的报道并不多见，更没有关于该病毒对抗宿主先天免疫的研究，作为副粘病毒的一种，其对抗机制与其他已报道的副粘病毒是否相似尚存在差异，值得探讨。笔者利用自主分离的1株APMV6，表达其P、V、W蛋白，用于对抗机制的研究。笔者首先发现V蛋白能够抑制IFN-β启动子的活性，但并不清楚V蛋白作用于该启动子NF-κΒ、PRDⅢ/I、AP-1中的哪个部分。笔者进行了进一步验证试验，发现V蛋白对这3个部分都具有抑制作用，但对NF-κΒ启动子的活性显著抑制。

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The V Protein of Avian Paramyxovirus Type 6 Antagonizes Beta Interferon Production of Host Cells

TIAN Zhi-ge, CHAI Hong-liang, HUA Yu-ping*

(Department of Wildlife Resource, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] To study the mechanism of avian paramyxovirus type 6 V protein antagonizing beta interferon production. [Method] The study constructed the combine plasmids pCDNA-P, pCDNA-V, pCDNA-W for expressing protein P, V, W, respectively. The 293T cells were cotransfected with combine plasmids and report gene plasmids, after SeV stimulating, the firely luciferase and Renilla luciferase activities were determined. [Result] The V protein remarkably inhibited beta interferon production by decreasing the NF-κB activity. [Conclusion] The study clarified the mechanism of V protein antagonizing innate immunity of host cells preliminarily.

Prarmyxovirus; V protein; Antagonize; Beta interferon

中央高校基本科研业务费专项(2572014AA03)；林业公益性行业科研专项(201404404)。

田志革(1985- )，女，黑龙江大庆人，博士研究生，研究方向：动物病毒学及分子生物学研究。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事野鸟疾病监测与防治研究。

2014-11-24

S 852.65+7

A

0517-6611(2015)01-130-02