黑木耳多糖的制备及其抗凝血功能的研究

李德海， 史锦硕， 周 聪， 孙宏伟， 王振宇

(1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150086)



黑木耳多糖的制备及其抗凝血功能的研究

李德海1， 史锦硕1， 周 聪1， 孙宏伟1， 王振宇2*

(1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150086)

[目的] 探讨黑木耳多糖的制备并研究其抗凝血功能。[方法] 采用水、酸溶液及碱溶液对黑木耳多糖进行提取制备，并以APTT、PT、TT 3个体外抗凝血指标为衡量依据，分别对其抗凝血功能进行了研究。[结果]试验表明，水溶性黑木耳多糖的提取率最高，而碱溶性多糖的纯度最高，且除蛋白后多糖纯度高于除蛋白前，可达到83.05%。抗凝血试验表明，水溶性、酸溶性和碱溶性3种黑木耳多糖均能显著延长家兔血浆的APTT(P<0.01)，而对PT和TT无明显影响(P>0.01)，并且APTT的值与多糖浓度呈正相关。多糖对APTT的作用强弱顺序为碱溶性>水溶性>酸溶性，且除蛋白后的多糖对APTT的作用效果均高于除蛋白前。[结论] 研究可为黑木耳多糖在抗凝血临床方面的应用提供参考依据。

黑木耳多糖；制备；抗凝血

黑木耳又名叫木耳、云耳等，是一种非常珍贵的并且具有食用价值和药用价值的胶质真菌[1]，主要生长在我国的东北三省以及湖北、福建、四川、广东、山东、贵州、云南等省份。在药用价值方面，我国医学历来认为黑木耳也是一种药用价值较高的药用菌，也是目前公认的可食性保健品，其子实体具有清肺益气、滋润补血、止痛镇定、活血化瘀的功效，也被用于治疗血管硬化、高血压、子宫出血、便秘等。研究表明，黑木耳多糖还具有抗氧化[2]、抗凝血[3]、抗肿瘤[4]、抗衰老[5]、降血糖[6]、降血脂[5]等作用。目前已有一些报告证明其确实具有抗凝血功效，笔者以APTT、PT、TT 3个体外抗凝血指标为衡量依据，分别测定酸溶液、碱溶液和蒸馏水提取的黑木耳多糖的抗凝血功效，并讨论除蛋白对该生理功效的影响，从而筛选出抗凝血效果最好的一种黑木耳多糖，为黑木耳多糖在抗凝血临床方面的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料天然野生黑木耳由黑龙江省大兴安岭兴安有机食品有限公司提供。试验中所用试剂均为分析纯。肝素钠由solarbio公司提供，效价≥140 U/mg；活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(白陶土，凝固法)、凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(冻干型，凝固法)、凝血酶时间(TT)测定试剂盒(凝固法)由上海太阳生物技术有限公司提供。

TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂；722s分光光度计，上海第三分析仪器厂；JA2003分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；DK-8D电热恒温水槽，巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器公司；Finnpipette移液枪，美国Thermo Lab-system公司；FM-100粉碎机，日本1watani公司；HH-4数显恒温水浴锅，江苏省金坛荣华仪器制造有限公司；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1黑木耳多糖的提取及制备。将市购的黑木耳除杂、粉碎，过60目筛，用3倍体积的石油醚浸泡24 h进行脱脂处理。

准确称取脱脂后的黑木耳干粉，分别按料液比1∶100 g/ml加入蒸馏水、0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液后，于90 ℃的水浴中浸提4 h，提取液以4 000 r/ min离心10 min。然后采用H2O2脱色法对得到的黑木耳多糖进行脱色处理，测定并记录其多糖含量。

将得到的3种黑木耳多糖溶液分别分为2份，一份经旋转浓缩后采用糖液3倍体积的无水乙醇醇沉，过滤，冷冻干燥成粉，用于不除蛋白的活性研究；另一份采用Sevage法除蛋白后，将得到的上清液旋转浓缩后同样采用糖液3倍体积的无水乙醇醇沉，过滤，冷冻干燥成粉，用于除蛋白后的活性研究。

1.2.2多糖含量的测定。该试验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

1.2.2.1标准曲线的绘制。用分析天平准确称取40 mg经干燥恒重的葡萄糖粉末，用蒸馏水溶解并定容至500 ml容量瓶中。然后准确吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 ml的葡萄糖标准溶液，再补加蒸馏水至2.0 ml。以蒸馏水做空白对照。分别加入1.0 ml的6%的苯酚溶液和5.0 ml的浓硫酸溶液，静止10 min，摇匀。再在室温条件下放置20 min。然后在波长490 nm处测定其吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线(图1)。回归方程：Y=-0.001 8+0.011 2X。

1.2.2.2多糖含量的测定。准确吸取2.0 ml多糖溶液，然后加入1.0 ml的6%的苯酚溶液和5.0 ml的浓硫酸溶液，静止10 min，摇匀。再在室温条件下放置20 min。然后在波长490 nm处测定其吸光值，按下面的公式可计算出溶液中的多糖含量。

式中，V为所测溶液体积(ml)；Y为吸光值。

1.2.3黑木耳多糖抗凝血作用的评价。以活化部分凝血活

酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)3个体外抗凝血指标作为检测指标，对不同溶液提取所获多糖的抗凝血效果进行研究。动物混合血浆的制备：选择成年健康家兔，心脏取血，用 0.109 mol/L 柠檬酸钠抗凝(体积比10∶1)，3 000 r/min 离心15 min，取上清血浆备用。分别准确吸取6种不同的黑木耳多糖样品与已制备好的成年家兔血浆以1∶4的体积比混匀成待测血浆，然后以等量的0.002 6 mg/ml肝素钠代替样品作为阳性对照组，以等量的生理盐水(0.9%)代替待测样品作为阴性对照组。APTT、PT、TT 3个指标的测定方法参照试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 不同溶液浸提黑木耳多糖得率的比较分别用蒸馏水、酸溶液、碱溶液提取黑木耳多糖，并分别设除蛋白前组及除蛋白后组，测定几种多糖的得率及多糖纯度结果如表1所示。

表1 不同溶液对黑木耳多糖提取影响的比较 %

由表1可知，水溶性黑木耳多糖得率最高，碱溶性次之，酸溶性最低，其得率分别为18.55%、15.34%、10.38%。而多糖纯度由大到小依次为：碱溶性黑木耳多糖、水溶性黑木耳多糖、酸溶性黑木耳多糖，且除蛋白后多糖纯度高于除蛋白前。

2.2 不同溶液提取黑木耳多糖抗凝血的分析

2.2.1黑木耳多糖抗凝血功能性的研究。配制10 mg/ml的多糖溶液进行黑木耳多糖抗凝血功能的初步研究。家兔血浆中分别加入6种黑木耳多糖后，3项凝血指标(APTT、PT、TT)的测定结果如表2所示。

表2 黑木耳多糖抗凝血研究

注：表中数据为平均值±标准差(其中n=3)，试验组数均为3；与阴性对照组相比较，**表示P<0.01。

由表2可以看出，与生理盐水阴性对照组相比，6种黑木耳多糖对APTT有显著的延长作用(P<0.01)，而对PT及TT均无明显作用(P>0.01)。医学上根据凝血现象的触发机理的不同，将凝血过程划分为外源性凝血机制和内源性凝血机制。APTT、TT和PT是各自独立的基础性凝血途径筛查指标，APTT反映内源性凝血系统的活性，PT反映外源性凝血途径的指标[7]。分析该试验结果表明，黑木耳多糖主要通过内源性凝血机制发挥其抗凝血作用。这与申建和等在黑木耳多糖、银耳多糖、银耳孢子多糖的抗凝血作用中的体内抗凝血试验研究结果相一致，主要差别在于该试验研究的是黑木耳多糖的体外抗凝血[8]。故后续试验选取APTT作为抗凝血检测指标。

2.2.2不同浓度水溶性黑木耳多糖对兔血浆APTT的影响。分别选取2、6、10 mg/ml 3个浓度梯度的水溶性黑木耳多糖溶液与兔血浆混合，测定其APTT的值，并对比除蛋白处理对APTT的影响，结果见表3。

表3 水溶性黑木耳多糖对APTT的影响

注：表中数据为平均值±标准差(其中n=3)，试验组数均为3。

由表3可以看出，与阴性对照组相比，3种浓度的水溶性黑木耳多糖对兔血浆的APTT值均有显著延长效果(P<0.01)，但其APTT值仍均低于阳性对照组。同时可以看出，兔血浆的APTT值随水溶性黑木耳多糖浓度的增大而增大，并且经过除蛋白处理的多糖其兔血浆的APTT值高于同浓度未除蛋白的多糖。

2.2.3不同浓度酸溶性黑木耳多糖对兔血浆APTT的影响。分别选取2、6、10 mg/ml 3个浓度梯度的酸溶性黑木耳多糖溶液与兔血浆混合，测定血浆的APTT值，对比多糖除蛋白前后对APTT的影响，结果如表4所示。

表4 酸溶性黑木耳多糖抗凝血作用分析

注：表中数据为平均值±标准差(其中n=3)，试验组数均为3组。

由表4可以看出，与阴性对照组相比，除2 mg/ml未除蛋白的酸溶性黑木耳多糖的血浆APTT没有显著延长(P>0.05)以外，其他较高浓度及2 mg/ml的除蛋白后的酸溶性多糖均可以显著延长血浆的APTT(P<0.01)。但该试验3种浓度的酸溶性多糖的血浆APTT值均小于阳性对照组。从表4中还可看出，APTT的值与多糖浓度呈正相关。并且加入除蛋白后多糖的血浆APTT值均高于加入同浓度未除蛋白多糖的。

2.2.4不同浓度碱溶性黑木耳多糖对兔血浆APTT的影响。同样选取2、6、10 mg/ml 3个浓度梯度的碱溶性黑木耳多糖溶液与兔血浆混合，测定血浆的APTT值，并对比多糖除蛋白前后对APTT的影响，结果如表5所示。

表5 碱溶性黑木耳多糖抗凝血作用分析

注：表中数据为平均值±标准差(其中n=3)，试验组数均为3组。

由表5可以看出，相比于阴性对照组，3种不同浓度的碱溶性黑木耳多糖均可以显著延长血浆的APTT(P<0.01)，尤其是10 mg/ml除蛋白后的碱溶性黑木耳多糖，使血浆的APTT延长至阴性对照组的4倍左右，已与0.002 6 mg/ml的肝素钠阳性对照组取得了相当的抗凝血效果。并且从数据中可以看出，APTT随多糖浓度的增大而延长。对于经过除蛋白处理的碱溶性多糖，浓度为10 mg/ml时血浆的APTT比浓度为2 mg/ml时延长了近2倍。同时可看出，除过蛋白的多糖其血浆的APTT值大于同浓度未除蛋白多糖的。

综合表3、4、5可以看出，水溶性、酸溶性和碱溶性黑木耳多糖相比于阴性对照组，均使血浆的APTT显著延长(P<0.01)。并且在试验范围内，APTT的值与多糖浓度呈正相关，说明黑木耳多糖的抗凝血功效在一定范围内有一定的剂量依赖性，这与王辰龙等的研究结果相一致[9]。其中碱溶性黑木耳多糖对APTT的延长效果最明显，其次为水溶性黑木耳多糖，酸溶性黑木耳多糖最弱；而对于同一种溶液提取的黑木耳多糖来说，其除蛋白前后对APTT的延长效果也有显著差别，除蛋白后的多糖对APTT的延长效果均高于除蛋白前。推测可能是由于除蛋白时除去了黑木耳粗多糖中游离的蛋白质，使其单位作用面积上的多糖浓度大大提高，因此使得其抗凝血效果得到了显著性的增加。

3 结论

3.1 黑木耳多糖的提取黑木耳多糖经不同pH的溶液提取，其提取率存在着明显的差异性。其中水溶性黑木耳多糖的提取率最高，约为18.55%，其次为碱溶性黑木耳多糖15.34%，酸溶性黑木耳多糖最低，约为10.38%；多糖含量关系为：碱溶性>水溶性>酸溶性，且除蛋白后多糖含量高于除蛋白前。

3.2 黑木耳多糖的抗凝血性该试验提取得到的水溶性、酸溶性和碱溶性黑木耳多糖相比于阴性对照均对APTT有明显的延长效果，并且这种效果在一定范围内有一定的剂量依赖性，而对PT和TT值无明显影响。不同溶液提取的黑木耳多糖对APTT的延长效果强弱顺序为：碱溶性>水溶性>酸溶性；并且除蛋白处理可以在一定程度上提高其该功效。因此综合多糖提取率和含量考虑可得出，经除蛋白处理的碱溶性黑木耳多糖最适合作为一种天然抗凝血活性成分进行更进一步的研究。

以上结论为黑木耳多糖在抗凝血方面的应用奠定了基础，其具体抗凝血机制还有待进一步的研究。

[1] 王振宇,张宁,赵鑫.酸溶性黑木耳多糖抗氧化性研究[J].中国林副特产,2011(3)：4-6.

[2] 赵鑫.黑木耳分级多糖抗氧化活性及其相关生理功能研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2011.

[3] 樊一桥,武谦虎,盛健惠.黑木耳多糖抗血栓作用的研究[J].中国生化药物杂志,2009,30(6)：410-412.

[4] 平兆华，许小娟，张俐娜，等.黑木耳β-葡聚糖抗肿瘤活性研究[R].上海：全国高分子学术论文报告会，2013.

[5] 周国华.黑木耳多糖抗衰老及降血脂生物功效的研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2005.

[6] 韩春然,马永强,唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用[J].食品与生物技术学报,2006,25(5)：111-114.

[7] 徐美玲,孙黎明,周大勇，等.皱纹盘鲍性腺多糖体外免疫活性和抗凝血活性的研究[J].水产科学,2009,28(9)：498-500.

[8] 申建和,陈琼华.黑木耳多糖、银耳多糖、银耳抱子多糖的抗凝血作用[J].中国药科大学学报,1987,18(2)：137-140.

[9] 王辰龙,张子奇,王曼，等.黑木耳多糖的提取分离及体外抗凝血作用研究[J].食品工业科技,2013(9)：238-241.

Preparation of Polysaccharides fromAuriculariaauricularand Analysis of Their Anticoagulant Function

LI De-hai1, SHI Jin-shuo1, ZHOU Cong1, WANG Zhen-yu2*et al

(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. College of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin, Heilongjiang 150086)

[Objective] To discuss the preparation of polysaccharides fromAuriculariaauricular, and study its anticoagulant function. [Method] Water, acid solution and alkaline solution were used to extract the polysaccharides fromAuriculariaauricular. With APTT, PT, TT as basis, its anti-clotting function was studied. [Result] The results showed that the water-soluble polysaccharides fromAuriculariaauricularhad the highest extraction rate, while the alkali-soluble polysaccharide had the highest purity, and the purity of the polysaccharide which had protein removed was higher than those hadn’t, reaching 83.05%. The results showed that three kinds of polysaccharides fromAuriculariaauricularcan significantly prolong rabbits plasma APTT (P<0.01), whereas no significant effect on PT or TT (P>0.01). The value of APTT and polysaccharide concentrations were positively correlated. The order of the effect which Polysaccharides took on APTT was alkali-soluble> water-soluble> acid soluble. In addition, removal of protein can increase the effect on APTT. [Conclusion] The study can provide reference basis for application ofAuriculariaauricularpolysaccharides in anticoagulant.

Polysaccharides fromAuriculariaauricular; Preparation;Anticoagulant

黑木耳即食产品开发关键技术研究项目(GA13B202)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572014CA19)。

李德海 (1976- )，男，山东茌平人，副教授，硕士生导师，从事食品化学及植物有效成分研究。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事天然产物分离与功能性食品开发研究。

2014-11-24

S 646.6

A

0517-6611(2015)02-283-03