四川部分鸡场禽网状内皮组织增生症病毒感染情况调查

任玉鹏，张焕容，王小楠，索化夷，汤　承，岳　华（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）



四川部分鸡场禽网状内皮组织增生症病毒感染情况调查

任玉鹏，张焕容＊，王小楠，索化夷，汤承，岳华
（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

摘 要：对四川部分鸡场禽网状内皮组织增生症病毒（REV）感染情况进行调查，为鸡群REV净化和防控提供依据。采用文献报道的PCR方法，分别对来自四川新津、温江、眉山、大邑、崇州和德阳等地6个肉种鸡群共160只外表健康鸡或生长发育不良、具有腺胃炎症状的鸡只样本进行PCR检测，同时将扩增片段克隆测序以确定其正确性。结果表明，6个鸡群REV群体阳性率均为100%（6/6），其中外表健康鸡REV检出率为65.8%（79/120），患腺胃炎病鸡REV检出率为82.5%（33/40）；同一只鸡不同组织器官样本的检测结果显示，REV在骨髓和法氏囊中的检出率最高，分别为30%（36/120）和28.3%（34/120），提示骨髓和法氏囊是REV检测的主要靶器官；患腺胃炎鸡的腺胃中REV检出率达25%（10/40），而外表健康鸡腺胃样本REV阳性率仅0.8%（1/120），表明REV是导致鸡腺胃炎的重要病原之一。

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒；靶器官；腺胃炎；PCR检测

禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis，RE）是由网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）引起的一种以禽类急性网状细胞肿瘤、矮小综合征、淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤形成为特征的一类病理性综合征。患病鸡常表现为生长发育不良，胸腺和法氏囊萎缩，多器官肿瘤病变等特征［1］。REV属于C型反转录病毒属成员，自1958年报道从火鸡脾脏中分离到首株REV以来，本病就在亚欧各地广泛流行。近年来如匈牙利［2］、印度［3］、韩国［4］等都有该病发生的报道。在我国鸡群中REV感染状况也普遍存在［5］，Sun S H等［6］从来自广东的三黄鸡受精卵中分离到一株REV；赵丽青等［7］对山东胶东地区REV血清学调查结果表明其检出率高达85.71%～100%。从各地流行病学调查情况看，单纯REV感染禽多不表现出典型的临床症状，主要以病鸡的渐进性消瘦和因免疫抑制而继发感染其他病原引起的病死率上升为特征，特别是在与马立克病病毒（MDV）和禽白血病病毒（ALV）等免疫抑制性或肿瘤性病毒混合感染时，可使病情严重程度明显加剧。研究表明，MDV与REV均可导致肿瘤病变，但在不同脏器中的含量和分布却不相同，且共感染可延长病毒血症时间，混合感染可显著增加患病鸡病死率［8］。对REV与J亚群ALV（ALV-J）共感染动物模型抗体监测发现，REV可显著减弱鸡体对ALV-J感染诱导的特异性抗体反应［9］。因此，了解本地区鸡群REV的流行情况，对鸡群有效净化REV，提高鸡群免疫水平和防控肿瘤性禽病具有重要意义。

本研究采用文献报道的REV PCR方法检测来自四川新津、温江、眉山、大邑、崇州和德阳等地6个肉种鸡群的3个品种1日龄120只外表健康鸡和40只35日龄～40日龄具有典型的生长发育不良和腺胃炎症状病鸡的肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、胸腺、法氏囊和骨髓等不同组织样本，分析样本中REV阳性率，以期丰富该地区REV流行病学资料，为本地区鸡场种源净化和家禽疫病防控提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株及鸡胚 REV-T株（毒株编号：AV107）购自中国兽药监察所；SPF鸡胚购自成都天邦生物制品有限公司。

1.1.2主要试剂 Trizol试剂为Invitrogen公司产品；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD19-T Simple Vector、PrimescriptTMRT reagent Kit为宝生物工程（大连）有限公司产品；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、EZNA Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒为OMEGA公司产品。

1.2方法

1.2.1引物的合成 按参考文献［10］合成REV特异性扩增引物：P1：5′-ATCCAATCACGAGCAAACACG-3′；P2：5′-GCCAGCCTACACCACGAACAAAAT-3′。扩增目的片段长度为270 bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。

1.2.2阳性样本的制备 以REV-T株病毒做阳性样本，按试剂盒说明书，用Trizol法抽提病毒RNA。用PrimescriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA；反应体系为：5×buffer 4μL；Prime Script RT Enzyme MixⅠ1μL；Random 6 mer（100）mol/L）2μL；模板4μL；加入RNase Free dH2O至20μL。反应条件：37℃15min，85℃15s，置-20℃保存备用。

以制备的REV cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为：P1/P2引物各1μL（10μmol/L），dNTP（2.5mmol/L）2μL，10×PCR buffer 3.5 μL，r Taq DNA聚合酶0.15μL，cDNA模板2μL，加入ddH2O至25μL。反应条件为：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min；置-20℃保存备用。取PCR扩增产物3μL，在含溴乙锭（EB）的琼脂糖凝胶板上点样，加入DNA分子质量标准作对照，以130V电压电泳40min，在凝胶成像仪中观察并拍照。

1.2.3样品的采集与处理 从四川省新津、温江、眉山、大邑、崇州和德阳等地的6个肉种鸡养殖场，无菌采集3个品种120只1日龄外表健康鸡和40 只35日龄～40日龄腺胃炎（腺胃肿胀、腺胃乳头出血或消失）、生长发育不良病鸡的肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、胸腺、法氏囊和骨髓样品各约1g，碾碎后置于1.5mL离心管，按1∶5（m∶v）加入无菌PBS充分混匀。用酚-氯仿法抽提样品总DNA，具体方法见参考文献［11］。将制备的核酸样本置-20℃保存备用。

1.2.4PCR检测及分析 以制备的待检鸡只不同组织器官的核酸样本为模板，进行PCR扩增。反应体系及反应条件同“1.2.2阳性样本制备”。取上述扩增产物和制备的阳性对照样本各3μL，在含溴乙锭的琼脂糖凝胶板上点样，加入DNA分子质量标准作对照，以130V恒压电泳40min，在凝胶成像仪中观察结果。参照《分子克隆》（第3版）［12］将基因片段克隆至pMD19-T载体，命名为pMDREV，并送样到上海英骏生物技术有限公司测序，用Blast比对分析结果。统计受检鸡群REV群体阳性率、个体阳性率和不同组织器官的REV检出率。

2　结果

2.1阳性样本的PCR扩增结果

将提取的REV-T株RNA反转录为cDNA作阳性模板，ddH2O作阴性模板，用P1/P2特异性引物分别对阳性模板及临床样本进行PCR扩增，经凝胶电泳后，获得约为270bp大小的条带，与预期目的基因长度一致（图1）。

2.2临床样本扩增产物的克隆与测序结果

随机构建的临床样本PCR扩增产物重组质粒pMD-REV经上海英骏生物技术有限公司测序，并用Blast比对分析结果表明，扩增片段与REV LTR基因核苷酸序列同源性均大于94.7%。测序结果如下：CCATGGTTGTAAGGGCAGATGCTATCCTCCAATGAGGGAAAATGTCATGCAACATC CTGTAAGCGGCTATATAAGCCAGGTGCATC TCTTGCTCGGGGTCGCCGTCCTACACATTGT TGTGACGTGCGGCCCAGATTCGAATCTGTA ATAAAAGCTTTTTCTTCTATATCCTCAGAT TGGCAGTGAGAGGAGATTTTGTTCGTGGGG TATAAGAGGGGGAAA。

图1　REV LTR基因片段RT-PCR扩增结果Fig.1 Amplified results of LTR REV gene segment by RT-PCR

2.3临床样本的检测结果

2.3.1外表健康肉鸡REV检测结果 经PCR检测，6个肉种鸡群120只1日龄外表健康肉鸡REV阳性检出率为65.8%（79/120），群体阳性率为100%（6/6），提示所检地区肉种鸡群REV广泛流行，且隐性感染率较高（表1）。其中青脚麻鸡、三黄鸡和艾维茵鸡REV阳性率分别为66.7%、62.5% 和70.0%，差异不显著（P＞0.05），表明REV对3个品种肉鸡均有较高易感性。

2.3.2腺胃炎病鸡REV检测结果 对来自新津、大邑、崇州和温江的4个鸡群40只35日龄～40日龄临床表现为腺胃炎（腺胃肿胀、腺胃乳头出血或消失）、生长停滞，渐进性消瘦，胸腺、法氏囊萎缩的肉鸡不同组织器官PCR检测结果表明REV检出率为82.5%（表2）。

2.3.3不同组织器官REV检测结果 外表健康鸡骨髓和法氏囊样品阳性检出率最高，分别为30.0%和28.3%；肝脏检出率为1.7%，腺胃的检出率最低，仅为0.8%（表3）。腺胃炎病鸡在法氏囊中检出率为30%，在骨髓和腺胃的检出率为25%，肝脏的检出率仅2.5%。结果表明，不论亚临床症状或发病鸡只，在骨髓和法氏囊中REV阳性检出率均最高；而临床腺胃炎病鸡腺胃中REV阳性检出率显著高于外表健康鸡，提示对患病鸡REV检测时，腺胃也是具有重要诊断意义的靶器官之一。

表1　外表健康肉鸡REV阳性检出率Table 1 REV positive rate of detected broiler flocks

表2　腺胃炎肉鸡的REV检测结果Table 2 The detection result of REV in proventriculitis broilers

表3　不同组织器官的REV阳性检出率Table 3 The positive rate of REV in different tissues

3　讨论

RE的实验室诊断和流行病学调查常用方法主要包括分子生物学方法和免疫学诊断法。由于REV毒株血清型单一，不存在主要亚型间差异，故琼扩试验、免疫组化、间接免疫荧光（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等免疫学检测方法具有良好的特异性。Li K等［13］用重组毕赤酵母表达的REV gp90蛋白作包被抗原建立了一种间接ELISA方法，与病毒中和试验及商品化试剂盒检测结果符合率均高于96.3%；张文娟等［14］用pGEX-4T-3载体原核表达env基因片段，将重组蛋白做抗原建立的间接ELISA法与已有的IFA法和IDEXX公司IREV-ELISA试剂盒进行比较，结果符合率均高于90%，表明该方法适用于大规模REV抗体的监测。此外随着分子生物学的发展，PCR、荧光定量PCR［15］及环介导等温PCR［16］等技术以其快速、灵敏、特异的特点被广泛应用于多种禽病病原的实验室检测；目前关于REV的分子生物学检测法主要针对其LTR、pol和env基因的保守区设计引物；吴萍萍等［17］分别用REV LTR基因和鸡传染性贫血病毒（CIAV）全基因序列为模板设计引物建立了一种敏感特异的双重PCR检测法；Deng X等［18］则应用环介导等温PCR扩增技术，以pol基因为靶基因初步建立了一种新型的REV检测法，可用于不同REV株的鉴别；因此本试验参考文献合成的一对基于LTR基因的特异性引物，用于分子流行病学调查，检测结果具可靠性。

本研究对采自四川部分肉鸡场不同品种外表健康肉鸡多种组织器官的PCR检测结果表明，各器官REV阳性检出率差异显著。其中骨髓和法氏囊样本阳性检出率最高，这与刘绍琼等［19］用免疫组化法和间接免疫荧光法对REV抗原定位的研究结果相符，提示病毒对这两种器官具一定的偏嗜性，骨髓和法氏囊是REV检测的重要靶器官。另外，在本研究中，临床表现为腺胃炎症状的35日龄～40日龄肉鸡腺胃样本REV阳性率显著高于1日龄外表健康肉鸡腺胃样本，分析REV的存在与腺胃炎症状的出现密切相关，至于究竟是REV感染导致腺胃炎，还是其他因素引起腺胃炎后使得机体对REV的易感性增强，有待进一步的验证。此外本实验室还对样本的ALV感染情况同时进行了调查，发现ALV和REV共感染率达46.7%，故临床腺胃炎病鸡腺胃组织中这两种病原检出率的显著升高可能是由于这两种病原的混合或继发感染所致。据现有研究资料报道，由于REV在基因组复制过程中，其前病毒DNA除能整合到宿主细胞基因组外，还可通过整合到共感染病原的基因组上增强共感染病原对宿主细胞的感染能力；继发感染对宿主机体防御屏障的破坏也可间接增强REV的感染力。

本试验对取自四川省6个县市6群外表健康1日龄肉种鸡和4群临床表现为腺胃炎的病鸡样品PCR检测结果表明，受检鸡群REV阳性率为100%（6/6），其中外表健康鸡群REV阳性率高达65.8%（79/120），临床表现为腺胃炎的鸡群REV阳性率高达82.5%（33/40），提示该病毒在本地区鸡群中广泛存在。因此对REV的有效防控，除净化鸡群REV外，防止继发感染或混合感染ALV、MDV等病原也是重点。

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Survey of Reticuloendotheliosis Virus Infection in Chicken Farms of Sichuan Province

REN Yu-peng，ZHANG Huan-rong，WANG Xiao-nan，SUO Hua-yi，TANG Cheng，YUE Hua
（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

Abstract：In order to investigate reticuloendotheliosis virus（REV）infection in Sichuan province to provide theoretical basis for the prevention of REV，apairs of specific primers were synthesized according to the reference，and a total of 120one-day-old apparently healthy chickens and 40proventriculitis suffered chicks of 35to 40day-old age from 6poultry farms were tested by PCR.The amplified fragments were cloned into pMD19-T vector and were sequenced for identification.The results showed that the detected positive rate of REV in six groups were 100%（6/6），the detected positive rate in 120apparently healthy chickens was 65.8%（79/120）and in that of 40proventriculitis suffered chicks was 82.5%（33/40）.It suggested that REV widely spread in Xinjin，Wenjiang，Meishan，Dayi，Chongzhou and Deyang of Sichuan province. The detected positive rates in different collected chicken tissue samples were also significantly different among various tissue samples，with the higher positive rates in both bursa of Fabricius（28.3%）and marrow（30%）in apparently healthy chickens，which implied that these two organs were the better detection target organs of REV.In addition，the REV detection rate in chicks suffered proventriculitis was significantly higher than that of apparently healthy chickens.It showed that REV may be related to proventriculitis.

Key words：REV；target organ；proventriculitis；PCR detection

作者简介：任玉鹏（1986-），男，四川雅安人，实验师，主要从事动物传染病病原分子生物学研究。＊通讯作者

基金项目：“十二五”国家高技术研究发展（863）计划项目（2012AA101304）

收稿日期：2014-11-20

中图分类号：S852.65

文献标识码：B

文章编号：1007-5038（2015）06-0162-05