5-Aza-CdR和低氧对小鼠海马中蛋白磷酸酶-1γ表达及对学习记忆的影响

张柱霞，孙明英，杨　洁，姜树原，刘　友，闫少春，邵　国（包头医学院中心实验室生物医学研究中心，内蒙古包头014010）

5-Aza-CdR和低氧对小鼠海马中蛋白磷酸酶-1γ表达及对学习记忆的影响

张柱霞△，孙明英△，杨洁，姜树原，刘友，闫少春，邵国＊
（包头医学院中心实验室生物医学研究中心，内蒙古包头014010）

摘 要：通过使用去甲基化试剂5-氮-2'脱氧胞苷（5-aza-2'deoxycytidine，5-Aza-CdR）和低氧处理小鼠，从而揭示低氧和5-Aza-CdR对蛋白磷酸酶1γ（protein serine/threonine phosphatase-1γ，PP1γ）表达的影响以及对小鼠学习记忆的影响。水迷宫筛选小鼠，正常小鼠随机分为对照组和试验组2组，分别给小鼠大脑立体定位注射10g/L BSA和10μmol/L 5-Aza-CdR至右侧脑室，休息1周，水迷宫测试小鼠学习记忆能力情况，然后依次处死低氧后3、2、1、0d的小鼠。最后通过Real-time PCR检测蛋白磷酸酶1的转录水平的表达。5-Aza-CdR和低氧分别处理小鼠都会提高小鼠的学习记忆能力，抑制PP1γmRNA的转录水平，但是联合处理对小鼠的PP1γmRNA转录水平却没有影响。说明5-Aza-CdR和低氧抑制PP1γ的转录水平，促进小鼠海马区突触可塑性的形成。

关键词：蛋白磷酸酶1；5-Aza-CdR；低氧；小鼠；学习记忆

低氧/缺血（I/H）是目前临床上最常见的病症，也是各种疾病致死的原因，糖尿病［1］、脑梗死［2］、高血压［3］、脑中风［4-6］等老年人病都是由于I/H造成死亡的相关疾病。I/H 不仅严重威胁着老年人的身体

健康，现在也对婴幼儿［7-9］的健康造成了一定的威胁。高原反应也是一种常见的低氧反应［10-11］。脑是I/H最容易受伤的部位，因此我们研究对象选择了小鼠海马。

蛋白磷酸酶1（protein serine/threonine phosphatase-1，PP1）是一种可以催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的酶分子［12］，与蛋白激酶相互依存，共同构成了去磷酸化和磷酸化这一重要的蛋白质活性开关调控系统。作为一种重要的高度保守的蛋白磷酸酶之一［13］，PP1由PP1α，PP1β/δ和PP1γ 3种相关基因编码，相关研究表明80%以上蛋白质的去磷酸化反应是由PP1α和PP1γ操纵的［14］。PP1γ在新陈代谢中发挥着重要的作用［15］，与PKA等共同构成细胞内糖原代谢的调节网络，在功能上表现出与PKA相互拮抗的生理效应，即抑制糖原的分解代谢、加速糖原的合成。我们前期的研究表明PP1γ启动子区含有丰富的GC，影响PP1γ启动子区甲基化水平的表达［15］。海马组织是大脑对I/H最为敏感的部位，本研究利用小鼠模型，研究成年小鼠海马组织中PP1γ的变化，并探讨小鼠突触可塑性的形成是否与PP1γ启动子区甲基化的表达有关。

核苷酸类似物5-Aza-CdR作为去甲基化试剂［16］，可以抑制PP1γ启动区甲基化，因此研究PP1γ在神经发育和分化、突触可塑性，学习记忆以及维持神经元的生存等相关基因的表达方面具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1小鼠 18g～22g雄性昆明小鼠60只（6周～8周），购自内蒙古大学动物实验中心。

1.1.2试剂和设备 大脑立体定位仪，瑞沃德生命科学技术（深圳中国）有限公司；水迷宫，包头医学院解剖实验室提供；Real-time PCR仪，7900HT，ABI公司产品；5-Aza-CdR，Sigma公司产品；Trizol，TaKaRa公司产品；Superscript III，Invitrogen公司产品；2× Real-time PCR Mix，南京凯基公司产品；其余试剂为国产试剂。手术器材和麻醉剂等其他均由解剖实验室提供。

1.2方法

1.2.1小鼠大脑立体定位注射5-Aza-CdR 10g/L戊巴比妥纳麻醉小鼠，固定于大脑立体定位注射仪器上，头顶部去毛，消毒皮肤，在头顶部正中切口，暴露前囟，依据小鼠立位图谱，于前囟后0.5mm，中线右侧1mm，微量注射器自脑表面垂直进针2.5mm，试验组向右侧脑室缓慢注入5μL10μmol/L的5-Aza-CdR，每次注射时间为5min，留针2min，缓慢退针。皮肤切口处用青霉素抗菌，缝合伤口。对照组注射等体积的10g/L的BSA。

1.2.2Morris水迷宫小鼠学习记忆能力的测定 水迷宫为直径130cm、高50cm的圆形水池，水深30 cm，用加热器使水温保持在22℃～26℃，池壁上有4根支柱，它们把水池等分为四个象限，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，在第Ⅰ象限正中间放置一个圆形透明的平台，保证平台顶部低于水面1cm（图1）。测定小鼠对水迷宫学习和记忆的能力。将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠找到平台的时间。4次训练小鼠分别从4个不同的象限入水点入水，如果小鼠在2min之内找到平台的记录到达的时间，并让其在平台上记忆20s，2 min内未找到平台的，需将其引导到平台，也让其学习记忆20s，这时潜伏期记为120s。

试验历时8d，第1天进行小鼠的筛选试验，选择出那些普通的小鼠（既不是很聪明也不笨的小鼠）。大脑立体定位注射完成之后连续学习5d，隔天再进行最后的测试。

图1　小鼠水迷宫装置Fig.1 Water maze device in mice

1.2.3定量PCR 使用Trizol提取总RNA，Nondrop 2000微量分光光度计检测总RNA的纯度和含量。SuperscriptⅢ试剂盒（Invitrogen公司）逆转录总RNA成为cDNA，于-20℃保存。引物由Invitrogen公司合成，引物序列如表1。使用ABI公司的96孔板，依次加入cDNA 1μL，1μL的引物，无菌水8μL，Mix 10μL，在ABI7900HT Real-time PCR反应仪上反应，每个样本设置3个重复空。反应条件为：预变性94℃3min；92℃30s，59℃30s，72℃30s，共40个循环；最后72℃延伸5min停止反应。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4统计学分析 所有数据结果以-x±SD表示，用SPSS10.0数据统计软件ANOVA和Tukey对组间数据进行处理和分析，以P＜0.05为显著差别的界限。

2　结果

2.1重复低氧可以增加小鼠在低氧条件下的耐受时间

小鼠低氧耐受时间随着低氧次数的增加而成倍的增长，即低氧预适应可以提高小鼠的耐受时间（图2）。

图2　小鼠不同低氧次数的耐受时间记录Fig.2 Tolerance time records of hypoxia in mice

2.2小鼠大脑立体定位注射5-Aza-CdR 2d后水迷宫测试结果

预试验注射亚甲基蓝结果证明操作能够成功准确的注射药物到达小鼠侧脑室（图3），使后期的试验可以顺利开展。与对照组相比，注射5-Aza-CdR组的小鼠能够在更短的时间内找到隐藏的平台逃生。而且随着学习时间的延长，小鼠的学习记忆能力增强，能够在更短的时间内到达平台（图4）。

图3　小鼠侧脑室注射亚甲基蓝溶液Fig.3 Methylene blue was injected into tricorn of mouse

图4　不同处理的小鼠找到平台时间记录Fig.4 Find platform time records in different treatments of mice

2.3低氧对小鼠海马中PP1mRNA表达的影响

PP1γmRNA相对丰度以delta-delta CT值表示，低氧使小鼠PP1γ转录水平降低，而且随着低氧后恢复时间的延长PP1γ转录水平降低（图5）。

图5　低氧对小鼠海马PP1γmRNA转录水平的影响Fig.5 PP1γmRNA expression levels of hippocampus in hypoxia mice

2.4低氧对5-Aza-CdR处理过的小鼠海马PP1γ转录水平的影响

注射5-Aza-CdR的小鼠海马PP1γ表达量明显低于对照组（P≤0.05）。单纯的低氧使小鼠海马PP1γmRNA转录水平降低，但是侧脑室注射了5-Aza-CdR后再低氧PP1γmRNA转录水平基本没变化（图6）。

图6　低氧和5-Aza-CdR对小鼠海马PP1转录水平的影响Fig.6 PP1γtranscriptional levels in mice treated by hypoxia and 5-Aza-CdR

3　讨论

Janssen最早对高海拔引起认知功能下降有报道，在攀登Mont-Blanc过程中出现了对呼吸深度调节，手指运动协调性等认知能力下降的情况。后期大量高山探险活动中出现的有关高海拔对情绪、认知和知觉的改变相继被报道。而且低氧环境对机体作业能力及认知能力的影响引起了医学研究的关注。低氧很容易引起情绪躁动不安和活动量增大［17］，从而使体内的氧迅速被消耗，小鼠达到死亡点的时间缩短。剧烈运动和焦躁的情绪会使体内代谢加快，耗氧量增加，重复低氧使小鼠产生记忆，停止剧烈的运动，减少能量的消耗，为其维持基本生命活动所必须的糖和氧。而低氧预适应则会提高小鼠的学习记忆和空间识别能力［18］。图3的结果证明了这一结论。也说明了小鼠也有一定的学习记忆的能力，经过多次重复的低氧，小鼠大脑内对其存在了记忆，均匀的呼吸，安静的呆着，从而减少氧的消耗，延长了存活时间。

有研究报道，DNA甲基化在神经发育和分化，突触可塑性，学习记忆以及维持神经元的存在等相关基因的表达方面具有重要作用［19-20］，催化DNA甲基化的酶为DNA甲基转移酶。DNA复制过程中核苷酸类似物5-Aza-CdR可以与DNMTs共价结合形成复合物从而抑制其甲基转移酶活性。先前的研究表明，PP1γ启动子区符合CpG岛特征。因此本试验通过使用PP1γ启动子区甲基化抑制剂，研究PP1γ与突触可塑性的形成是否与其启动子区甲基化有关。水迷宫多被用于从事动物空间学习记忆能力的相关研究。隐藏平台获得试验中，逃避潜伏期反映小鼠学习能力的变化。图4的结果证明了上述的猜想，5-Aza-CdR注射到小鼠侧脑室，抑制了PP1γ启动子区的甲基化的发生，使其启动子区甲基化表达降低，同时5-Aza-CdR注射组小鼠找到平台的时间低于正常小鼠，因此PP1γ参与学习记忆极有可能是其启动子区甲基化调控的。糖和氧的持续供应是维持细胞新陈代谢和正常功能所必须的，低氧引起ATP产生不足而使细胞受到损伤。因此，I/ H环境下细胞存活的关键是避免ATP的快速下降，而神经细胞可以通过改变基因表达而改变其代谢策略使细胞在特殊环境下而生存。PP1γ在神经细胞能量代谢中有重要的作用，PP1γ转录起始点上游有一段300bp的GC含量高达79%的区域，控制着PP1的转录。我们前期的研究显示低氧预适应过程中PP1γ磷酸酶的活力可能降低［21］。PP1靶蛋白之一的环腺苷酸应答原件结合蛋白（CREB）在神经细胞功能中有重要的作用，CREB的功能的变化是通过其丝氨酸（Ser-133）磷酸化变化实现的，而其丝氨酸的去磷酸化作用是由PP1调节的，一些与新陈代谢相关基因，如Bcl-2等通过CREB参与到低氧或氧化抑制条件下的神经保护，利用急性低氧预适应小鼠模型发现小鼠海马CREB的磷酸化水平升高［22］。本试验的研究结果与其相对应，低氧会降低PP1γ转录水平（图6）。

低氧和5-Aza-CdR都对PP1γmRNA转录水平有抑制作用，而且都会促进小鼠的学习记忆能力。但是联合5-Aza-CdR和低氧处理小鼠，其PP1γmRNA转录水平没有变化。

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Effects of Hypoxia and 5-Aza-CdR on Protein Phosphatase1γExpressed in Hippocampus and Learning and Memory in Mice

ZHANG Zhu-xia，SUN Ming-ying，YANG Jie，JIANG Shu-yuan，LIU You，YAN Shao-chun，SHAO Guo
（Biomedicine Research Center of Baotou Medical College，Baotou，Inner Mongolia，014010 China）

Abstract：The aim of this study was to detect the effect of 5-aza-2'deoxycytidine（5-Aza-CdR）and hypoxia tolerance on protein phosphatase1γ，and then explore the relationship between the memory and learning in mice.The mice were screened by water maze，the ordinary mice were randomly divided into groups：control mice injected with 10g/L BSA and experimental mice injected with 10μmol/L 5μL 5-Aza-CdR，and then they were tested in water maze，and treated by hypoxia，and last they were euthanasia after one/two/there day hypoxia.The hippocampis were taken，and the mRNA levels of protein phosphatase-1γwere measured. The results showed that 5-Aza-CdR and hypoxia can up-regulated the ability of learning and memory，down-regulated the PP1γmRNA level，but unchanged if 5-Aza-CdR and hypoxia acted on mice if them were treated at the same time.PP1γmRNA levels were inhibited by 5-Aza-CdR and hypoxia，the formation of synaptic plasticity was promoted.

Key words：protein phosphatase1γ；5-Aza-CdR；hypoxia；mouse；learning and memory

作者简介：张柱霞（1988-），女，山东莘县人，硕士研究生，主要从事生物化学和分子生物学研究。孙明英（1990-），女，内蒙古赤峰人，主要从事生物化学和分子生物学研究。△同等贡献作者。＊通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目（81060212，81160244，81360316，81460283）；内蒙古自然科学基金资助项目（2010BS1104；2014MS0810）；中国博士后基金项目（20080430851）；内蒙古自治区高等学校科研项目（NJZY12221，NJZY12225）；内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划资助（NJYT-13-A10）；研究生科研创新项目（S201410127（Y02））；教育部留学回国人员科研启动基金（46批）

收稿日期：2015-05-11

中图分类号：S852.23

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）09-0059-05