蚕豆中5种内源激素的高效液相色谱测定

王萌，张海惠，刘琪，张利

(四川农业大学，四川 雅安　625014)



蚕豆中5种内源激素的高效液相色谱测定

王萌，张海惠，刘琪，张利

(四川农业大学，四川 雅安625014)

摘要：采用高效液相色谱法分离和测定蚕豆中的吲哚乙酸、激动素、赤霉素、脱落酸和玉米素5种植物内源激素.结果表明：选用80%甲醇作为样品提取溶剂，经石油醚和乙酸乙酯萃取，采用Diamonsil C18色谱柱进行分离，以甲醇∶0.075%冰乙酸(45∶55；V/V)溶液为流动相，流速0.7 mL/min，波长254 nm的检测条件下，蚕豆中各激素的分离效果理想，25 min内全部出峰，加样回收率达88.9%～97.3%.经测定蚕豆中吲哚乙酸、激动素、赤霉素、脱落酸和玉米素质量分数分别为15.2、35.0、332.9、2.4、9.23 ng/g，该方法满足激素定量分析的要求，能快速、准确的测定蚕豆内源激素.

关键词：蚕豆；高效液相色谱；内源激素

第一作者：王萌(1985-)，女，讲师，博士，研究方向为植物资源的评价与利用.E-mail:wangmeng.728@163.com

蚕豆(Viciafaba)属于豆科，营养丰富，用途广泛，是中国重要的粮食、蔬菜、副食、饲料和养地作物，如何调控其生长发育，进而提高其产量与品质近年来备受关注.植物激素对植物的种子萌发、生长、开花、成熟、衰老、休眠等活动起着间接或直接的调节、控制作用[1].目前，国内对豆类作物的研究主要集中在矿质元素、氨基酸、蛋白质等营养成份，对于内源激素的研究比较少，而关于蚕豆的相关研究更为少见[2].

植物内源激素含量低，性质不稳定，加之细胞中其他化合物的干扰，故测定方法必须十分灵敏和专一[3].目前植物内源激素的检测主要有生物鉴定法[4]、气相色谱法[5]、 酶联免疫法[6]、光谱测定法[7]、放射免疫法[8]和高效液相色谱法(HPLC)[9]等.HPLC法具有灵敏度高、专一性强、重复性好等特点，除了乙烯外，其它内源激素均可以用HPLC法进行检测，且可以实现几种激素的同时测定，应用最为广泛.因此，本研究拟采用HPLC法针对蚕豆中的吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)5种内源激素进行检测分析，旨在为蚕豆品质提高、性状改良及开发利用提供一定的理论依据.

1材料与方法

1.1试验材料

试验用蚕豆种植于四川农业大学生命科学学院植物园中，挑选生长健壮的蚕豆植株，取叶片后置于-20 ℃冰箱中保存备用.

1.2仪器与试剂

LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；RM-220超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；KQ3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BT124s电子天平.

吲哚乙酸、激动素标准品(成都科龙化工试剂厂，纯度≥99.0%)；赤霉素标准品(Sigma公司，纯度≥99.0%)；脱落酸标准品(上海蓝季科技发展有限公司，纯度≥99.0%)；玉米素标准品(上海生物科技有限公司，纯度≥99.0%)；石油醚、乙酸乙酯、冰乙酸均为分析纯；甲醇为色谱纯；试验用水为超纯水.所以试剂在使用前均用0.45 μm微孔滤膜过滤.

1.3色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.075% 冰乙酸水溶液(体积比45∶55)等度洗脱，紫外检测波长254 nm，柱温20 ℃，流速0.7 mL/min，进样量10 μL.

1.4标准溶液的配制

精密称取IAA 1.10 mg、KT 1.22 mg、ABA 0.56 mg、ZT 1.06 mg，均用80%甲醇溶液溶解标准品定容于10.00 mL，GA34.44 mg定容于25.00 mL的容量瓶中，摇匀.分别从中精密吸取IAA 1.00 mL、KT 5.00 mL、GA310.00 mL、ABA 1.00 mL、ZT 1.00 mL置于25.00 mL的棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制IAA 4.40 μg/mL、KT 24.4 μg/mL、GA371.4 μg/mL、ABA 2.24 μg/mL、ZT 4.24 μg/mL的混合标准溶液.避光4℃下存放备用.

1.5样品前处理

样品前处理参照王世平等的方法并加以改进与优化[10].准确称取5.0 g蚕豆叶片，加入50 mL预冷的80%甲醇，冰浴研磨成浆，4 ℃避光冷浸过夜.抽滤后得上清液，残渣再用80%甲醇提取2次(40 mL、20 mL各2 h)，合并上清液，40 ℃下旋转减压浓缩至干.分别用10 mL的磷酸缓冲液(pH=8.0)和10 mL的石油醚冲洗蒸馏瓶，合并冲洗液抽滤后，滤液用2倍体积的石油醚萃取3次，弃醚相.水相调整pH=8，等体积乙酸乙酯萃取3次，取酯相并调水相pH至8后等体积乙酸乙酯萃取3次，合并所有酯相40 ℃减压浓缩至干，用80%甲醇溶解残留物并定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析.

2结果与分析

2.1色谱条件优选

2.1.1流动相的确定利用高效液相色谱测定植物细胞内源激素含量，由于所用色谱柱的种类不同，中所用的流动相种类差别较大.常用的流动相有甲醇-0.6%乙酸梯度洗脱[11]；乙腈-甲醇-0.6 %乙酸( 5∶50∶45，V/V)[12]；甲醇-水-乙酸(50∶45∶5，V/V)[13]；甲醇-乙腈-磷酸(15∶15∶70，V/V)[14]；乙腈-10 mmol/L乙酸钠(20∶80，V/V)[15]，乙腈-0.02 mol/L醋酸缓冲液(25∶75，V/V)[16].通过综合比较上述各种流动相经过Diamonsil C18色谱柱对蚕豆5种内源激素分离效果，优化后发现用甲醇∶0.075%冰乙酸(45∶55，V/V)溶液为流动相时，分离效果最好，且在25 min内全部出峰.

2.1.2流速的确定分离时间随流速的变化而变化，流速越大，各组分被洗脱出来时间就越短，即每分析一个样品所耗时间越短，但流速太快，也会影响各组分的分离效果.基于流速要使各组分吸收峰能完全分离而又保留时间相对较短，在流动相、柱温、检测器波长等条件一定的情况下，使用等度洗脱分别考察了流速为0.4、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min时的分离效果，最终确定最佳流速选用0.7 mL/min.

2.1.3波长的确定检测波长是影响液相色谱检测结果的一个重要因素.首先对GA3和ABA标准液在紫外检测器下进行扫描，确定其吸收波长范围，为液相色谱检测波长的选择提供依据.检测结果显示GA3最大吸收波长为253 nm，ABA 最大吸收波长为257 nm.而对ZT、IAA、KT的甲醇溶液均在250～270 nm之间有最大响应，综合分析，考虑到UV-检测器在254 nm处灵敏度最高，本试验选用254 nm作为5种内源激素的检测波长，检测效果最佳.

2.2线性关系考察

根据色谱条件，精密吸取5种激素的混合对照品溶液1、5、10、15、20、25 μL依次进样，测定其峰面积(图1).

以进样量x为横坐标，色谱峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归，分别得5种激素回归方程、保留时间、相关系数、线性范围列于表1，表明5种激素在相应的范围内线性关系良好.

1：玉米素(ZT)；2：赤霉素(GA3)；3：激动素(KT)；4：3-吲哚乙酸(IAA)；5：脱落酸(ABA).图1　5种内源激素混合对照品的色谱图Fig.1　Chromatogram of the five mixedhoemones standars

内源激素回归方程保留时间/min相关系数线性范围/μgIAAy=(6.42×10-7)x-2.32×10-46.4550.99990.0044～0.11KTy=(2.13×10-7)x+1.04×10-222.4780.99980.0244～0.61GA3y=(1.84×10-5)x+4.53×10-24.1200.99970.07104～1.776ABAy=(1.53×10-7)x+2.18×10-48.3270.99990.00224～0.056ZTy=(2.41×10-7)x+7.70×10-414.0810.99970.00424～0.106

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验分别精密吸取同一混合供试品溶液10 μL，连续进样5次，结果得IAA、KT、GA3、ABA和ZT的RSD分别为0.16%、0.5%、1.1%、3.9%、0.5%.

2.3.2稳定性试验取冷暗处放置的同一份供试品溶液，在同样色谱条件下于0、2、4、6、8、10、12 h分别进样分析，每次10 μL测定色谱峰面积，IAA、KT、GA3、ABA和ZT的RSD分别为3.9%、0.7%、0.7%、3.1%、0.6%，结果显示溶液在12 h内较稳定.

2.3.3重复性试验精密称取同一份样品5份，按照1.5项制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别进样10 μL，进行含量测定.结果测得IAA、KT、GA3、ABA和ZT的平均质量分数RSD分别为1.0%、1.4%、4.8%、2.0%、0.7%，表明该方法重现性较好.

2.3.4回收率试验采用加样回收法，准确称取已知5种内源激素含量的蚕豆叶片5份，每份5.000 g，每份样品中均吸取1 mL IAA 0.052 μg/mL、KT 0.188 μg/mL、GA30.977 μg/mL、ABA 0.018 μg/mL和ZT 0.042 μg/mL的标准品溶液，按照1.5项下方法进行供试品制备，在上述色谱条件下，进样10 μL进行含量测定，重复3次计算回收率，其测定结果及RSD值参见表2.

2.4样品测定

分别精密吸取对照品与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行色谱分析.平行测定3次，采用外标法计算蚕豆叶片中IAA、KT、GA3、ABA、ZT的含量，含量结果及RSD值见表3，HPLC色谱图见图2.

表2　5种激素的回收率

1：玉米素(ZT)；2：赤霉素(GA3)；3：激动素(KT)；4：3-吲哚乙酸(IAA)；5：脱落酸(ABA)图2　蚕豆叶片中5种内源激素的色谱图Fig.2　Chromatogram of the five endogenoushoemones in Vicia faba

内源激素IAAKTGA3ABAZT质量分数/(ng·g-1)15.235.0332.92.49.23RSD/%3.95.716.141.271.35

3结论

本试验通过优化蚕豆中5种内源激素的提取条件及色谱条件，建立了一种简单、有效的运用HPLC同时检测蚕豆中5种内源激素的分析方法.选用甲醇∶0.075%冰乙酸(45∶55，V/V)溶液为流动相，检测波长254 nm，流速0.7 mL/min时分离效果理想，加样回收率达88.9 %～97.3 %.该方法满足激素定量分析的测定要求，为进一步检查蚕豆生长发育过程中内源激素的变化、激素代谢等相关研究提供了关键技术.

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(责任编辑李辛)

Stimutaneous determination of five endogenous hormones in

Viciafababy high performance liquid chromatography

WANG Meng，ZHANG Hai-hui，LIU Qi，ZHANG Li

(Sichuan Agricultural University,Ya'an 625014,China)

Abstract：A high performance liquid chromatography was developed to separate and determine the five endogenous hormones including IAA,KT,GA3,ABA and ZT inViciafaba.The results showed that the five endogenous hormones were well separated in 25 min,and their recoveries were between 88.9% and 97.3% by using 80% methanol as the extraction solvent,then extracted by petroleum ether and ethyl acetate and the chromatographic conditions was as follows: Diamonsil C18chromatographic column,mobile phase formed as methanol and 0.075% acetic acid (V/Vratio of 45∶55 ),the flow rate at 0.7 mL/min,and the detection wavelength at 254 nm.The measurement showed that the content of IAA,KT,GA3,ABA and Zt was 15.2 ng/g,35.0 ng/g,332.9 ng/g,2.4 ng/g and 9.23 ng/g,respectively.The method can meet the demand of quantitative analysis of hormones and can be used to quickly and accurately separate and measure the content of endogenous hormones inViciafaba.

Key words：Viciafaba;high performance liquid chromatography;endogenous

收稿日期：2014-09-28；修回日期：2014-12-11

基金项目：四川省科技厅科技支撑计划项目(2014FZ0056).

通信作者：张利，女，教授，博生生导师，研究方向为植物化学成分分析.E-mail:zhang8434@sina.com

中图分类号：S 643.6

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)06-0058-04