两种圆柏属植物叶绿体膜脂肪酸组成和ATP酶活力的季节变化特征与比较

张有福，陈春艳，陈拓

(1.河南科技大学农学院,河南 洛阳　471003;2.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所,甘肃 兰州　730000)



两种圆柏属植物叶绿体膜脂肪酸组成和ATP酶活力的季节变化特征与比较

张有福1，陈春艳1，陈拓2

(1.河南科技大学农学院,河南 洛阳471003;2.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所,甘肃 兰州730000)

摘要：以2种常绿的祁连圆柏(SabinaprzewalskiiKom.)和圆柏(Sabinachinensis(Lin) Ant.)为材料，测定叶绿体膜脂脂肪酸组分及膜功能蛋白活力的季节变化，比较分析2种植物的种间差异.结果表明：祁连圆柏和圆柏叶绿体膜脂中不饱和脂肪酸亚油酸(18∶2)、亚麻酸(18∶3)与月平均气温呈显著负相关，而饱和脂肪酸棕榈酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)与月平均气温呈显著正相关；K+Na+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase的活性也与月平均气温呈显著负相关.抗寒性强的祁连圆柏叶绿体膜脂中亚麻酸含量显著低于抗寒性弱的圆柏，而其饱和脂肪酸花生四烯酸含量显著高于圆柏.可见，季节性变化中不饱和脂肪酸的比例提高有利于圆柏属植物抗寒性增强，但不饱和脂肪酸含量高低并不是物种间抗寒性强弱的决定因素.

关键词：叶绿体；脂肪酸；ATP酶；圆柏；祁连圆柏

第一作者：张有福 (1978-) ，男，博士，副教授，主要从事植物逆境生理的研究.E-mail:zyfgau@163.com

植物细胞膜对环境变化极为敏感，其结构与功能的改变是植物对环境胁迫最初与最基本的反应[1].细胞膜是具有流动性的脂类和镶嵌其中的蛋白质分子组成.膜脂脂肪酸组分及其比例是决定膜流动性的关键因素，进一步影响到膜蛋白质的功能.研究发现，植物膜脂中不饱和脂肪酸比例高，有利于降低膜脂的相变温度，从而降低植物细胞耐受低温的临界温度，抗寒能力增强[2-3].然而膜脂组分和膜功能受到物种、环境及其二者相互作用的影响，其中高山常绿植物膜脂组分与温度的关系仍不清楚.低温是引起植物细胞膜结构和功能季节变化的关键环境因子.常绿植物叶龄长，可经历整年的季节性温度变化.常绿植物无疑是研究植物对季节性环境温度改变适应的理想材料.

叶绿体是最容易受到低温伤害的细胞器，其内部一些相关蛋白质均对低温敏感[4].在低温胁迫条件下，叶绿体的超微结构也易发生改变[5-6].研究发现，冬季低温会导致圆柏叶绿体基粒间连接松弛、部分基粒溶解的受害现象，但祁连圆柏叶绿体受害症状不明显[6]，说明二者叶绿体耐受低温的能力存在差异.推测这种差异与叶绿体膜脂组分和功能蛋白密切相关.因此，研究叶绿体膜脂组分和功能蛋白活性与环境温度季节变化的关系尤为重要.

祁连圆柏(SabinaprzewalskiiKom.)和圆柏(Sabinachinensis(Lin) Ant.)是我国西部山区常见的常绿树种.其中祁连圆柏主要分布在海拔2 600～4 000 m 的高山地区，而圆柏多分布在海拔500～1 900 m的丘陵地区[6].本研究通过分析两种圆柏属植物叶绿体膜脂脂肪酸组分和功能蛋白质活性的季节变化，探索叶绿体膜脂脂肪酸组成与环境温度变化的关系，为探讨植物适应高原气候的机制提供借鉴和参考.

1材料与方法

1.1试验区概况和样品采集

试验地位于兰州市东南20 km处的榆中县二阴山区(N 35°01′，E 103°33′)，海拔1 900 m.该区属干旱、半干旱气候区，气候干燥，夏季温和，冬季寒冷；年平均气温7.6 ℃，极端最高温度28.4 ℃，极端最低温度-13.9 ℃，年平均无霜期110 d；年平均降水量362 mm.材料培养和样品采集如简启亮等所述[7].2004年5月，将两树种的3年生实生苗移栽于试验地中.人工去除杂草，无遮阴.2006年的每月下旬采集树冠中部外围枝条上的叶样，每种树以10棵树样品混匀为1个重复，共3个重复.采集的样品用液氮固定后置于超低温冰箱(-80 ℃) 中保存直到测定.

1.2试验方法

参照Reeves和Hall的方法[8]，样品在预冷的提取液(50 mmol/L HEPES-NaOH(pH 7.5)，0.4 mol/L蔗糖，10 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2)4 ℃研磨成匀浆，过4层纱布，1 000g离心1 min，取上清，6 000g离心10 min，取沉淀，用2 mL提取液将沉淀悬起，4 ℃保存备用.用80%的丙酮提取离体叶绿体中叶绿素含量.膜脂脂肪酸提取和脂肪酸甲酯制备按Morrison和Smith的方法进行[9].叶绿体悬浮液加入2 mL CHCl3-CH3OH(1∶1,V/V)，待分层后，收集下层并低温蒸干形成极性脂的粗体物，然后加入2 mL 1.5% KOH甲醇在60 ℃皂化30 min，加入BF3甲醇溶液反应生成脂肪酸甲酯，加入正己烷将甲酯萃取.气相色谱(CP-3800)运行按照以下程序，以3℃/min的速率升温至250 ℃，然后保持5 min，载气为N2，流速是300 cm/s.南京建成公司试剂盒法测定Ca2+Mg2+-ATP和K+Na+-ATP酶的活性，具体方法参见南京建成公司的ATP酶测试盒说明书.

1.3数据处理

成对样本的t检验和相关分析采用SPSS 17.0软件.

2结果与分析

2.1叶绿体膜脂脂肪酸组成及其季节变化

两种圆柏属植物叶绿体膜脂脂肪酸的成分主要有饱和脂肪酸棕榈酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)和花生四烯酸(20∶0)，不饱和脂肪酸油酸(18∶1)、亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)， 其中不饱和度高的亚麻酸含量最高，其次为棕榈酸，油酸最低；不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸约占脂肪酸比例的60%.叶绿体不饱和脂肪酸的比例较高.它们的相对含量也发生明显的季节性变化(图1～2).在冬季，不饱和脂肪酸的比例提高，尤其亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)比例明显高于夏季；而饱和脂肪酸的比例降低，其中棕榈酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)显著低于其它季节.推测冬季不饱和脂肪酸的比例提高利于低温条件下膜功能的维持.

图1　不同季节祁连圆柏叶绿体脂肪酸的组成Fig.1　Fatty acid composition in isolated chloroplastsof S.przewalskii in different seasons

2.2叶绿体K+Na+-ATP酶的季节变化

2种圆柏属植物中叶绿体K+Na+-ATP酶活性的季节变化模式相似，均表现为冬季K+Na+-ATP酶活性高，而夏季低(图3).可见，季节性降温可提高叶绿体K+Na+-ATP酶的活性.

图2　不同季节圆柏叶绿体脂肪酸的组成Fig.2　Fatty acid composition in isolated chloroplastsof S.chinensis in different seasons

图3　不同月份祁连圆柏(SP)和圆柏(SC)叶绿体K+Na+-ATP酶的活性Fig.3　The K+Na+-ATPase activity in isolated chloroplasts of S.przewalskii (SP) andS.chinensis(SC) in different months

2.3叶绿体Ca2+Mg2+-ATP酶活的季节变化

如图4所示，祁连圆柏和圆柏植物叶绿体Ca2+Mg2+-ATP酶的活性均表现为冬季高，而夏季低，这与二者K+Na+-ATP酶的季节变化趋势也一致.季节性温度的变化对Ca2+Mg2+-ATP和K+Na+-ATP酶活性的影响是一致的.

2.4两种圆柏植物叶绿体脂肪酸组分和ATP酶的差异分析

经成对样本的t测验，圆柏叶绿体膜脂中油酸(18∶1)和亚麻酸(18∶3)含量显著高于祁连圆柏，而圆柏花生四烯酸(20∶0)含量显著低于祁连圆柏(P<0.05，表1).祁连圆柏叶绿体膜脂中棕榈酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)和亚油酸(18∶2)含量与圆柏之间差异不显著(P>0.05).叶绿体中Ca2+Mg2+-ATPase和K+Na+-ATPase的活性在两种圆柏之间差异也不显著(P>0.05).说明物种间膜脂组分受到饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸及其内部组分差异的影响.

2.5叶绿体膜脂组成和ATP酶活性与气温的相关性

两种圆柏属植物叶绿体膜脂中不饱和脂肪酸油酸(18∶1)、亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)与平均气温呈负相关，而饱和脂肪酸棕榈酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)和花生四烯酸(20∶0) 与月平均气温均呈正相关，其中棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和亚麻酸与月平均气温之间相关性显著(P<0.05，表2).叶绿体Ca2+Mg2+-ATPase和K+Na+-ATPase的活性与月平均气温呈极显著性负相关(P<0.01).表明季节性温度变化是影响叶绿体膜脂脂肪酸组分和ATP酶活性的重要因子.

图4　不同月份祁连圆柏(SP)和圆柏(SC)叶绿体Ca2+Mg2+-ATP酶的活性Fig.4　The Ca2+Mg2+-ATPase activity in isolated chloroplasts of S.przewalskii and S.chinensis in different months

树种16∶018∶018∶118∶218∶320∶0K+Na+-ATPCa2+Mg2+-ATPS.P22.4±1.52.0±0.46.4±0.621.1±1.729.5±1.318.5±2.66.41±0.66.3±0.7S.C24.7±1.61.7±0.59.8±1.119.0±1.136.9±1.57.9±1.56.47±0.55.0±0.5p0.1150.4590.0180.1050.0000.0010.9170.058

n=12；16∶0、18∶0、18∶1、18∶2、18∶3、20∶0的单位为%，Ca2+Mg2+-ATPase和K+Na+-ATPase单位为μmol/h/mg.

表2　月平均气温与叶绿体膜脂脂肪酸组分和ATP酶的泊松相关系数

*表示在0.05水平上相关性显著.

3讨论

类囊体膜属于叶绿体光合膜系统，光合膜中包含有将光能转化为化学能所需的许多功能蛋白，维持膜流动和稳定是植物正常生理代谢的基础[10].本研究表明季节性低温可诱导两种圆柏属植物叶绿体不饱和脂肪酸比例提高(表2).这有利于降低膜的相变温度和维持低温条件下植物膜的流动性与功能[11]；同时还有利于保护光合电子传递系统，减轻低温导致的光抑制[12].可见，冬季两种圆柏属植物叶绿体膜脂不饱和脂肪酸的增加可提高耐受低温的能力，也是二者适应季节性温度变化的反应.

一般认为，植物膜脂中不饱和程度高的脂肪酸含量与其耐寒性正相关[13].祁连圆柏的抗寒性强，但不饱和程度高的亚麻酸含量却显著低于抗寒性弱的圆柏(P<0.05，表1).这与Roche[14]在小麦叶绿体类囊体膜脂肪酸的组成与其抗寒性的关系研究一致，即叶绿体膜脂脂肪酸组与物种间抗寒性强弱无直接关系，认为低温下膜不饱和脂肪酸的增加只是植物适应低温的一种普遍规律.膜功能和流动性不仅与膜脂组成有关，还可能与其他因素有关，如适宜的膜脂和膜蛋白比率及其相互作用是调节膜功能的关键因素[15].另外，祁连圆柏膜系统的稳定也归因于较强的抗氧化保护系统[7,16].

叶绿体的ATP 酶是光合磷酸化的偶联因子，是一种与叶绿体膜结合的复合蛋白，其活性大小也反映植物光合磷酸化的程度[17].ATP酶常常因低温伤害而活力降低，进而引发细胞生理代谢紊乱.冬季祁连圆柏和圆柏叶绿素总含量降低[7]，而单位叶绿素K+Na+-ATP和Ca2+Mg2+-ATP酶活性升高(图3～4).通常低温会诱发细胞内Ca2+水平迅速提高，但细胞质中过高的Ca2+浓度或者维持其高浓度时间过长均会干扰细胞的生理代谢，导致代谢紊乱，造成细胞死亡，包括叶绿体外膜和质膜Ca2+Mg2+-ATP酶可以调节胞质Ca2+浓度，有助于胞内Ca2+稳态的维持，从而保证细胞的正常生理功能[18].因此，ATP酶活性提高有利于避免Ca2+对植物的毒害，也是2种圆柏属植物抗寒性的增强原因.抗寒性强的祁连圆柏叶绿体Ca2+Mg2+-ATP酶活性明显高于圆柏，但K+Na+-ATP酶活在两种植物之间差异较小.推断Ca2+Mg2+-ATP酶活性差异与圆柏属植物种间耐寒性差异有关，这也与祁连圆柏光能转化效率强于圆柏的研究结果相一致[19].既然祁连圆柏分布在光照强、气温低，且二者变化剧烈的高海拔地区，高的光化学转化效率及其细胞内离子和能量调节能力有利于适应气温的急剧变化.

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(责任编辑李辛)

Seasonal variation characteristics and comparison in

chloroplast membrane fatty acid composition

and ATPase activity in twoSabinatrees

ZHANG You-fu1，CHEN Chun-yan1，CHEN Tuo2

(1.College of Henan Science and Technology University,Luoyang 471003,China;2.Cold and Arid Region

Environmental and Engineering Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Abstract：Taking leaves ofSabinaprzewalskiiKom.andSabinachinensis(Lin) Ant as materials,chloroplast membrane fatty acid components and seasonal variation in membrane protein activity were measured to compare the inter-specific difference.The results showed that there was negative correlation between unsaturated fatty acid including linoleic acid (18∶2) and linolenic acid (18∶3) in chloroplast membrane lipid and monthly average temperature(MAT)inS.przewalskiiandS.chinensis.However the saturated fatty acid,such as palmitic acid (16∶0) and stearic acid (18∶0) were significantly positive correlated with MAT.The activity of K+Na+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase in chloroplasts also appeared significantly negative correlation with MAT in bothSabinatrees.Compared withS.chinensischaracterized by weak cold-resistance,S.przewalskiihad significant lower linolenic acid and higher arachidonic acid.Therefore,increase of unsaturated fatty acids ratios in seasonal cold helpSabinatrees to improve cold-resistance,while the content of unsaturated fatty acid is not determinant of cold-resistance for different tree species.

Key words：chloroplasts；fatty acids；ATPase；Sabinachinensis；Sabinaprzewalskii

收稿日期：2015-10-13；修回日期：2015-10-28

基金项目：国家自然科学基金项目(31200299)

中图分类号：S 791.44

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)06-0094-05