虎耳草水煎液对百草枯中毒小鼠SP-A的影响

窦 伟李亨东杨 锐曾 颖肖 潇李英伦*

（1.四川农业大学动物医学院药学试验室，四川雅安 625014；2.四川省畜牧科学研究院，四川成都 610066）

虎耳草水煎液对百草枯中毒小鼠SP-A的影响

窦 伟1李亨东1杨 锐2曾 颖1肖 潇1李英伦1*

（1.四川农业大学动物医学院药学试验室，四川雅安 625014；2.四川省畜牧科学研究院，四川成都 610066）

24只昆明小鼠随机分为对照组（8只，一次性灌胃生理盐水0.25 ml/只）、染毒组（8只，一次性灌胃百草枯水溶液250 mg/kg）和治疗组（8只，染毒小鼠按250 mg/kg剂量给予虎耳草水煎液灌胃治疗），给药2次/d，连续8 d。各组均于第9 d处死，取左肺制作石蜡切片。HE染色观察病理表现，免疫组化方法检测肺中表面活性蛋白A（surfactant-associated protein，SP-A）的含量。HE染色光镜病理观察，染毒组较对照组肺组织损伤程度显著加重，治疗组肺组织损伤减轻。染毒组肺泡上皮细胞SP-A表达的积分光密度（IOD）值明显高于对照组，同时高于治疗组。结果显示，百草枯中毒所致肺急性损伤在虎耳草水煎液的治疗下有所缓解和减轻症状。

虎耳草 百草枯 肺表面活性蛋白-A 免疫组化

百草枯（Paraquat，PQ）化学名1，1’-二甲基-4，4’-联吡啶阳离子盐，是全世界最常用的除草剂之一，我国是全球最大的生产和使用国；百草枯中毒死亡率在所有农药中居首位，研究百草枯中毒引起肺损伤的机理和治疗方法对救治百草枯中毒病例具有重要意义。本试验通过给服虎耳草水煎液（Saxifrage Decoction，SD）观察其对小鼠百草枯染毒后的治疗情况，探究虎耳草对百草枯中毒的药理作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

雌性昆明小鼠24只（SPF级），购于成都生物制品研究所，体重20±2.2 g。

1.1.2 药品与试剂

百草枯（体积分数20%的百草枯水溶液），郑州锦绣化工科技公司；生物素化山羊抗兔IgG、SP-A一抗、DAB显色剂、BSA封闭液、SABC均购自武汉博士德生物工程有限公司；虎耳草（Saxifrage），采自四川雅安宝兴县。

1.1.3 仪器

显微成像系统（Olympus）、OLIMPUS CH20BIMF200型光学显微镜、组织切片机（JP-40）。

1.2 方法

1.2.1 染毒与处理

试验小鼠随机分成三组，每组8只：对照组，一次性灌胃生理盐水0.25 ml/只；染毒组，经预试验检测确定染毒剂量及方案为：无菌生理盐水将百草枯水溶液稀释至体积分数0.2%，一次性灌胃0.25 ml，约合给药量250 mg/kg；治疗组，经染毒处理后（方法同染毒组），染毒后第2天开始给予治疗，浓缩至1mg/ml的虎耳草水煎液0.25 ml每天2次灌胃，连续给药8 d。第9 d处死全部三个组的小鼠，完整分离左肺，将其置于福尔马林溶液中固定，常规石蜡切片。

1.2.2 免疫组化染色

标本4 μm连续切片，37℃烤片12 h，甲苯脱蜡，梯度酒精水化，体积分数3%的H2O2室温孵育10 min，枸橼酸盐缓冲液中微沸10 min修复抗原，5% BSA封闭液，37℃中孵育20 min，甩去多余液体，滴加稀释后的SP-A抗体（0.6ml SP-A加入10 ml稀释液中），密封盒中保湿4℃孵育12 h，PBS缓冲液冲洗1 min，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，PBS缓冲液冲洗1 min，滴加SABC，37℃孵育20 min，PBS缓冲液冲洗1 min，DAB显色剂，37℃孵育30 min，蒸馏水冲洗2 min，苏木素复染1 min，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

2 结果

2.1 肺组织病理变化

对照组：双肺呈粉红色，表面光滑，组织结构正常。HE染色切片（见图 A）肺泡完整，组织正常。染毒组：眼观可见肺泡内水肿、瘀血。HE染色切片（见图B）中可见肺泡壁显著增厚，肺泡壁上的毛细血管扩张充血，肺泡上皮肿胀，并伴有炎性细胞浸润。支气管黏膜上皮的纤毛脱落消失。治疗组：眼观症状与染毒组基本相同，但程度较染毒组轻。HE染色切片（见图 C）病理变化较染毒组轻，但部分肺泡壁比对照组厚。

2.2 肺组织免疫组化染色

SP-A阳性物质位于细支气管黏膜上皮及肺泡Ⅱ型上皮细胞胞浆内，呈深棕黄色或亮黄色。对照组（见图D）黏膜上皮胞浆内均有阳性物质，且多染成棕黄色呈强阳性表达，肺泡上皮内亦见有较多阳性产物。染毒组（见图E）细支气管黏膜上皮和肺泡上皮胞浆内的阳性产物着色较对照组浅，且阳性细胞数量明显减少。治疗组（见图F）阳性细胞数量较模型组明显增多，但较对照组少。

肺组织免疫组化染色的切片光镜下随机选取3个视野，做光密度统计，结果显示，模型组积分光密度值与治疗组差异显著p≤0.05，健康组积分光密度值与模型组、治疗组差异均极显著p≤0.01，详见表1。

表1 免疫组化染色切片积分光密度值统计表

窦伟（1984-）男，四川德阳，硕士研究生。

李英伦（1965-）男，教授，博士。