番茄青枯病菌拮抗细菌的筛选及鉴定

罗 坤，胡利锋，刘开林，刘祥英，柏连阳

(1.湖南农业大学植物保护学院，湖南长沙410128;2.湖南农业科学院，湖南长沙410125)

番茄青枯病是由番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起的，是一种典型的土传病害，长期以来威胁着番茄的生产［1-2］。番茄青枯病的防治方法主要有抗病品种和化学防治，如农用硫酸链霉素、新植霉素等。番茄青枯病生物防治主要从土壤中或者植株中分离纯化筛选拮抗菌［3-4］，与番茄青枯病菌有相同的生态位，用于防治青枯病前景广阔［5-6］。笔者从番茄青枯病发病田块中的无病植株根际土壤中筛选获得拮抗细菌，鉴定了其分类地位，并通过盆栽试验验证了其防效，旨在为番茄青枯病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基。NA培养基:蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，酵母粉1.0 g，蔗糖/葡萄糖15.0 g，琼脂粉15.0 g，蒸馏水1 000ml，pH 7.0。

1.1.2 供试菌株。番茄青枯菌ND1由湖南农业大学农药研究所提供。

1.1.3 供试土样。土样样品采集于湖南省张家界市高峰乡，采集病田块中的健康植株的根围土壤。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分离、纯化与保存。采用稀释分离法。称取10 g土样，加入90 ml无菌水中，从浓度为1×10-5g/ml的菌液中吸取150 μl放入培养基中，涂板。涂布后的平板以30℃培养24 h后观察，挑取单菌落进行划线纯化，并编号［7］。

1.2.2 拮抗菌的筛选。采用抑菌圈法。以番茄青枯菌ND1为指示菌，检测细菌的拮抗效果。将待测菌接在含有青枯菌的NA平板中心，30℃下培养48 h后，观察有无抑菌圈形成。

1.2.3 拮抗菌的鉴定。

1.2.3.1 细菌的培养性状的观察。按《细菌分类学》的细菌培养性状方法进行培养性状的观察。

1.2.3.2 生理生化反应的测定。主要包括对拮抗菌进行氧化酶试验、过氧化氢酶试验、V-P试验、产H2S等试验。

1.2.3.3 细菌16S rDNA引物测序及分析。将筛选得到的拮抗细菌用通用引物16S rDNA进行测序。引物采用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R，即27F:AGA GTT TGATCCTGG CTCAG和1492R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT。反应程序:95℃变性5 min;94℃变性40 s，56℃复性40 s，72℃延伸90 s，32次循环;72℃延伸7min，4℃保存。再将PCR产物送交广东深圳华大基因有限公司进行测序，将序列提交NCBI数据库，应用Blast程序与数据库中已有的细菌16S rDNA序列进行同源性比较分析。序列的比较及系统发育分析采用MEGA4.0软件进行［8］。

1.2.4 拮抗菌88号菌株温室防效测定。接种病原菌3 d后，采用接抗菌88菌株发酵液灌根处理，设发病对照(CK)及链霉素对照，每处理4次重复，每重复5株番茄苗。记录14 d的发病情况，计算病情指数及相对防治效果。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌筛选结果 以番茄青枯菌ND1为供试菌，从高华乡番茄土样中分离纯化得到的104株细菌。将各类菌株分别进行拮抗作用测定，筛选到对番茄青枯病菌拮抗活性菌株有6株，占总数的5.7%。其中，菌株24号、菌株88号的抑菌半径分别达6.3和7.2 mm，菌株38号、菌株39号、菌株54号和菌株102号的抑菌半径相对较小，分别为2.5、2.7、1.2和2.3 mm(图1)。

2.2 细菌种类初步鉴定 菌株88号的形态学特征、培养性状在NA培养基上菌落生长慢，圆形、隆起、光滑、灰白色。在PDA培养基上菌落小，黄乳白色。在KB培养基上不产生荧光。G-，杆状，极生鞭毛，未见芽孢。形成菌膜阴性，甲基红阴性，VP试验阴性，石蕊牛乳产碱，明胶液化阳性，产生H2S阴性，产生吲哚阳性，硝酸盐还原阳性。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第九版，1994)所列的有关伯克氏属形态学与生理生化形状的描述初步认定拮抗细菌菌株88号属于伯克氏属(Burkholderia sp.)。

2.3 拮抗菌测序结果及分析 用16S rDNA通用引物，以菌株88的DNA为模板，经PCR反应扩增出1条约1 600 bp特异性片段，并同GenBank中16S rDNA序列进行比对，序列与越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)FJ577505.1序列同源性高达100%。运用MEGA3.0软件建立系统发育树(图2)，从菌株88所构建的系统进化树来看，它与许多越南伯克氏菌之间的进化距离相隔较近，与菌株88号的形态特征和生理生化指标测定的结果一致。

2.4 拮抗菌温室防控效果 结果表明，菌株88号对番茄青枯病菌14 d的防治效果为96.4%，极显著高于链霉素对照(表1)，拮抗菌88号具有较大的生防应用潜力。

3 讨论

番茄青枯病作为番茄生产上的一种顽固的土传性病害，不易防治［9］。而拮抗菌具有和病原菌相同生态位等显著特点，利用生物防治青枯病前景广阔。该试验在利用前人研究的方法筛选出1株细菌88号，对番茄青枯菌有很强的拮抗作用。经研究鉴定，该细菌均属于伯克氏属，与通常研究发现的青枯菌拮抗菌多属于芽孢杆菌属、假单胞杆菌属不同。分子鉴定结果显示，88号菌株为越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis)。此外发现，菌株88号对番茄晚疫病也有很强的拮抗作用，因此在防治番茄土传病害上具有很好的应用前景［10-11］。

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