何首乌饮对衰老大鼠睾丸组织c-fos蛋白表达的影响及其意义

李 然，张 杰，李玉芝，高福禄

(1.河北省承德县医院，河北 承德县 067400 2.河北省承德市中心医院，河北 承 德 067000)

c-fos正常表达与睾丸Leydig细胞分泌睾酮功能的关系密切［1］，应用D-半乳糖建立的亚急性雄性衰老大鼠模型成功后，测得中血清睾酮浓度明显降低［2］，何首乌饮能明显延缓下丘脑-垂体-睾丸衰老，使衰老大鼠血清睾酮、IGF-l含量升高［3］。本实验采用Western blot半定量法和免疫组织化学染色法观察睾丸组织中c-fos蛋白的表达，进而探讨何首乌饮抗衰老作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物的分组和处理:选用SPF级健康雄性8周龄SD大鼠40只，由河北省实验动物中心提供，其合格证号为1005050，体重在180～220g之间。随机将大鼠分为4组，每组10只:何首乌饮预防组(HP)，正常对照组(N)，何首乌饮治疗衰老组(HT)，模型组(M)。何首乌饮预防组(HP)、模型组(M)和何首乌饮治疗衰老组(HT)此三组大鼠，采用腹腔连续注射6%D-半乳糖，剂量为300mg/kg/d，60d，应用此种方法，进行建立亚急性衰老动物模型。何首乌饮预防组(HP)的大鼠在进行建立亚急性衰老动物模型的同时，再进行何首乌饮灌胃，连续60d，剂量为1mL/100g;何首乌饮治疗衰老组(HT)的大鼠，在建立亚急性衰老模型成功后，给予灌胃何首乌饮，剂量为1mL/100g，连续60d。

1.2 药物与试剂:c-fos免疫组化试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供;D-半乳糖，批号为0914B70，由北京化学试剂公司提供;BCA试剂盒，由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。何首乌饮的方剂由何首乌、淫羊霍、怀牛膝、肉苁蓉、丹参、茯苓组成，自河北省中医院购买，将所用药材均混合剪碎，用水浸泡1h，共煎2次，每次煎30min，然后混合前后2次水煎液，并进行过滤、浓缩，使液体含生药4.8g/mL，保存于4℃温度中，复温至25～30℃后予大鼠灌胃。

1.3 每组取5只大鼠，以4%多聚甲醛液体灌注并固定，取大鼠睾丸组织，进行常规石蜡包埋，并免疫组化染色;其余大鼠断头处死迅速取出双侧睾丸放入液氮中。

1.4 采用免疫组织化学法和Western Blot检测睾丸组织的c-fos蛋白的含量。

2 结果

用Western Blot法半定量分析表明，模型组与正常组相比明显降低(P＜0.01);何首乌饮用药后均能提高睾丸c-fos蛋白的表达(P＜0.01)，何首乌饮预防与延缓衰老组无显著性差别(P＞0.05)(Table 1，Table2和 Fig.1-3)

图1 各组大鼠睾丸组织c-fos蛋白的表达vs正常对照组:*P＜0.01;vs模型组#P＜0.05

图2 模型组大鼠睾丸组织生精细胞c-fos蛋白表达(×400)Fig.10 expression of c-fos in testis of rats

图3 何首乌饮治疗衰老组大鼠睾丸组织生精细胞c-fos蛋白表达(×400)

图4 大鼠睾丸组织c-fos蛋白表达

表1 用Western blotting法测得各组的c-fos蛋白(±s，n=5)

表1 用Western blotting法测得各组的c-fos蛋白(±s，n=5)

vs正常对照组:*P＜0.01;vs模型组#P＜0.05

组别 c-fos/β-actin正常对照组 1.89±0.24模型组 0.36±0.02*何首乌饮预防组 1.47±0.21#何首乌饮治疗衰老组 1.28±0.08#

3 讨论

研究衰老机制和抗衰老药物的前提是成功建立衰老动物模型，目前衰老动物模型主要有:D-半乳糖致衰老模型;胸腺摘除致衰老模型;臭氧损伤致衰老模型;自然衰老模型等。其中，自然衰老模型是最理想的衰老模型，但需要长时间饲养，个体差异较大，干扰因素较多，影响实验结果，且一般大鼠在16月进入衰老期，很难得到大样本的标本。摘除胸腺致衰老模型，存在手术摘除胸腺不干净，术中大鼠容易死亡或损伤而影响造模的成功;臭氧损伤致衰老模型省时易行，但臭氧量不易控制。D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型，1991年我国学者龚国清等依据自然衰老代谢特点变化提出，D-半乳糖衰老模型较真实的体现了自然衰老过程，又因实验周期短，为目前应用最多的衰老模型。给药方式有多种，如颈背皮下注射、腹腔注射、眼球后注射等，刘学丽等证明腹腔注射给药方式最好，但给药时间剂量都不尽相同，一般给药时间20～60d不等，给药剂量每日40～500mg/kg不等。本研究选用D-半乳糖腹腔大剂量注射来制作衰老模型，它衰老的变化过程符合自然衰老睾丸组织形态功能变化的特征，因而为可靠的衰老动物模型。

c-fos是编码核蛋白的癌基因，属于立早基因的成员。c-fos是分子量为62kD的磷酸化蛋白质，Fos与其他核内DNA结合蛋白组成调节转录的AP-l复合物，从而干扰其他基因的转录速率。c-fos作为细胞内信号传递的“第三信使”，具有调节细胞增殖、凋亡以及细胞内信号传递等重要的生理作用。目前通过PCR、免疫组织化学和原位杂交等技术方法已证实，睾丸组织的的间质细胞、支持细胞和生精细胞中均有某些原癌基因的表达，如 cmyb，c-jun，c-fos等，并且与睾丸的功能密切相关［4］。血清睾酮含量与衰老密切相关，同时衰老会导致睾酮下降这一结果目前已经得到广泛认同［5］。本课题组研究发现何首乌饮能够提高衰老模型大鼠血清中睾酮的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，可降低生精细胞的凋亡指数等［6］，平衡下丘脑的单胺类神经递质传递。

逐渐步入衰老年龄，由于睾丸组织血液供应不足，间质细胞数目减少，分泌功能降低，而呈现退行性改变，间质细胞合成睾酮不足，产生cAMP减少，从而导致精细胞的凋亡，使得老年人在生理性LH刺激下间质细胞应答减弱。本研究显示，睾丸生精细胞发生凋亡，其中衰老大鼠细胞凋亡明显多于正常组大鼠;cfos蛋白在睾丸组织的表达量模型组明显降低;何首乌饮能够降低生精细胞的凋亡，提高睾丸组织c-fos蛋白的表达，而且预防用药的效果要好于衰老后治疗的效果。

［1］ 况海斌，方廉.原癌基因与睾丸功能的关系［J］.中华男科学，2003，9(5):337～380

［2］ 况海斌，方廉，徐斯凡，等.c-Fos对大鼠间质细胞睾酮生成的影响及其作用机理［J］.江西医学院学报，2005，45(1):24～27

［3］ 王小杰，牛嗣云，张艳青，等.何首乌饮对雄性衰老大鼠生殖功能的保护作用［J］.时珍国医国药2011，22(3):532～535.

［4］ 高福禄，岳凤鸣，庞晓静，等.db/db自发性糖尿病小鼠睾丸 EGFR，c-fos表达研究［J］.解剖学杂志 2001，24(6):532～536.

［5］ 柳海燕，陶晓倩，时姗姗，等.大鼠睾丸间质细胞中促性腺激素释放激素激动剂调控睾酮合成的机制［J］.南京医科大学学报＜自然版＞，2009，29(10):1337～1341.

［6］ 陈志宏，齐聪儒，高福禄，等.天年饮对亚急性衰老大鼠睾丸组织SOD活性及生精细胞凋亡的影响［J］.四川中医，2004，22(8):11～12.