螺旋藻多糖对CHB患者PBMC免疫功能的影响

吕小华，陈文青，罗世英，吴 铁，吕世静

（广东医学院1．药理学教研室、2．检验学院，广东湛江 524023）

螺旋藻多糖对CHB患者PBMC免疫功能的影响

吕小华1，陈文青2，罗世英1，吴 铁1，吕世静2

（广东医学院1．药理学教研室、2．检验学院，广东湛江 524023）

中国图书分类号：R329．24；R392．12；R512．620．3；R977．6；R977．7

摘要：目的 观察螺旋藻多糖对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞免疫功能的影响。方法 运用MTT法和流式细胞术分别测定螺旋藻多糖对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞增殖能力和细胞周期的影响，采用ELISA法检测外周血单个核细胞培养上清细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4浓度，同时用RT-PCR法检测外周血单个核细胞IFN-γ mRNA的表达。结果 螺旋藻多糖能增强慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞的增殖能力，能增强慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞分泌IFN-γ和IL-2，且能降低分泌IL-4。螺旋藻多糖能上调慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞IFN-γ mRNA的表达。结论 螺旋藻多糖对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞的免疫功能具有调节作用。

关键词：螺旋藻多糖；慢性乙型肝炎；外周血单个核细胞；干扰素；白细胞介素-2；白细胞介素-4

网络出版时间：2015－7－22 10：42 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．022．html

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染人体后，机体的免疫反应决定疾病的发生、发展与转归，细胞免疫功能异常是造成HBV持续感染的主要原因之一。由于持续HBV感染及复制激发的免疫应答失调与慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者病情迁延不愈密切相关，而Th1／Th2平衡失调是其免疫功能紊乱的重要表现之一［1－2］。螺旋藻多糖（polysacchrides of Spirulina platensis，PSP）是从螺旋藻提取分离出来的水溶性多糖，是一类具有促进细胞生长、抗辐射、抗衰老、降血脂、抗肿瘤、免疫调节活性、促进蛋白质合成等功能的天然生物活性物质［3］。本研究通过观察PSP对CHB患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）免疫功能的影响，探讨PSP的免疫调节作用，从而为进一步研究PSP的药物开发提供理论和实验依据。

1　材料与方法

1．1研究对象 在广东医学院附属医院感染科治疗的CHB患者30例，其中CHB轻度、中度、重度患者各10例；其中男24例，女6例，年龄18～59岁。诊断和临床分型符合2000年联合修订的《病毒性肝炎防治方案》慢性乙型病毒性肝炎诊断标准。6例正常人均为健康体检者。所有的标本获取及处理都是经过患者的知情同意，经所在机构的医学伦理委员会批准。

1．2药物与试剂 螺旋藻粉由海南三亚海王海洋生物科技有限公司提供。采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取螺旋藻粗多糖，纯度达90%以上。RPMI 1640、TRIzol（美国Gibco公司）；Ficoll淋巴细胞分离液、MTT（美国Sigma公司）；RT-PCR两步法试剂盒（美国Promega公司）；ELISA试剂盒（深圳晶美生物工程公司）；PHA（上海伊华医学科技有限公司）。

1．3主要仪器 ELx800型酶标仪（美国BIO-TEK公司）；Epics-XL型流式细胞仪（美国COULTER公司）；CO2细胞培养箱（美国Shell／LAB公司）；PCR仪（宝生物工程有限公司）。

1．4PBMC的分离 无菌采集静脉血3 mL注入抗凝试管中，将血液缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液（Focill）中，以2 000 r·min－1，离心10 min，分离出PBMC。

1．5PSP对PBMC增殖功能的影响 用含20%新生小牛血清的RPMI 1640完全培养液稀释PB-MC，调整细胞浓度至2×109·L－1，将细胞悬液加入96孔培养板，每孔100 μL，分别加入10 mg·L－1PHA和25、50、100、200、400、1 000 mg·L－1PSP，同时加入PBS做阴性对照，最后加入RPMI 1640完全培养液补至每孔200 μL，置37℃、5%CO2培养箱中培养44 h后，每孔加入5 mg·L－1MTT 10 μL，继续培养4 h，每孔再加入三联液100 μL，混匀，放置过夜，次日用酶标仪检测各孔的吸光度OD570值。

1．6PSP对CHB患者PBMC细胞周期的影响将细胞悬液加入24孔培养板，每孔1 mL，分别加入10 mg·L－1PHA和100、200、400 mg·L－1PSP，置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，离心收集细胞，用PBS洗2次，加入70%冷乙醇固定细胞，4℃放置过夜，1 000 r·min－1，离心5 min，弃乙醇，用PBS洗沉淀2次，再用震荡器震散细胞，加入PI染液，混匀，15 min后在流式细胞仪检测。

1．7PSP对CHB患者PBMC分泌细胞因子的影响将细胞悬液加入24孔培养板，每孔1 mL，分别加入10 mg·L－1植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）和400 mg·L－1PSP，置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，1 000 r·min－1离心，收集上清，分别用IFN-γ、IL-2和IL-4 ELISA检测试剂盒定量上清液中的细胞因子含量。具体操作按ELISA说明书进行。

1．8PSP对CHB患者PBMC IFN-γ基因转录水平的影响 ①引物设计与合成：β-actin upstream：5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，downstream：5′-CAGGATTCCATACCCAAG-3′；INF-γ upstream：5′-TGTAGCGGATAATGGAAC-3′，downstream：5′-GTAT-TGCTTTGCGTTGGA-3′。②总RNA的提取：将细胞悬液加入24孔培养板，每孔1 mL，分别加入10 mg ·L－1PHA和100、200、400 mg·L－1PSP，培养48 h后，按TRIzol说明书提取RNA。③RT-PCR按试剂盒操作。取5 μL PCR产物，用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测，然后在紫外透射仪观察电泳结果并拍照。图片用Bandscan 4．3图像分析软件进行光密度积分值分析，计算出IFN-γ／β-actin mRNA的光密度积分值之比作为IFN-γ mRNA的相对含量值。

2　结果

2．1PSP对健康人和CHB患者PBMC增殖功能的影响 如Tab 1所示，在PHA的协同刺激下，PSP在浓度为50～400 mg·L－1范围能够促进PHA对健康人和CHB患者PBMC的增殖作用，且促进作用随着药物浓度的增加而增大，但浓度达1 000 mg·L－1时，促进作用有所下降。

2．2PSP对CHB患者PBMC细胞周期的影响结果如Tab 2和Fig 1所示，PHA对照组PBMC周期发生G0／G1期向S期转换，与空白对照组相比，差异具有显著性（P＜0.01）；低、中、高浓度药物组PB MCG0／G1期细胞明显降低，分别为80.25%、77.03%和75.78%，S期细胞明显增加，分别为12.27%、14.45%和17.68%，与PHA对照组相比，差异具有显著性（P＜0.05或P＜0．01）。

Tab 1 Effect of PSP on proliferation of PBMC from healthy individuals and patients with chronic hepatitis B virus infection（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of PSP on proliferation of PBMC from healthy individuals and patients with chronic hepatitis B virus infection（±s，n＝6）

＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs PHA group

Group　Concentration／mg·L－1　OD570（normal）　OD570（CHB）Control　－　0．180±0．010　0．096±0．008 PHA　－　0．250±0．004＃＃　0．146±0．004＃＃PSP　25　0．255±0．005　0．150±0．004 50　0．265±0．012*　0．154±0．004*100　0．279±0．008**　0．163±0．003**200　0．291±0．012**　0．174±0．004**400　0．304±0．008**　0．196±0．002**1 000　0．279±0．003**　0．168±0．003**

Tab 2 Effect of PSP on cell cycle of PBMC from patients with chronic hepatitis B virus infection（±s，n＝6）

Tab 2 Effect of PSP on cell cycle of PBMC from patients with chronic hepatitis B virus infection（±s，n＝6）

＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs PHA group

Group　Concentration／mg·L－1　G0／G1／%　S／%　G2／M／% Control　－　90．53±0．44　7．05±0．22　2．42±0．23 PHA　－　81．81±0．41＃＃11．63±0．27＃＃　6．45±0．25＃＃PSP　100　80．25±0．48　12．27±0．36*　7．48±0．17*200　77．03±0．27**14．45±0．35**　8．52±0．31**400　75．78±0．21**17．68±0．33**　6．53±0．31**

2．3PSP对CHB不同临床分型患者PBMC分泌细胞因子的影响 ELISA检测结果见Tab 3。相对于正常对照组，PHA单独诱导与联合PSP诱导相比，联合PSP诱导组使得PBMC产生IFN-γ和IL-2水平明显增高，与PHA单独诱导组相比差异具有显著性（P＜0.05）；但PBMC产生IL-4水平差异无显著性。对于CHB患者，PHA和PSP联合诱导后，PBMC产生IFN-γ水平明显增高，其中慢性中度和重度乙型肝炎患者组最为突出（P＜0.01）；PBMC产生IL-2水平也明显增高，其中慢性中度乙型肝炎患者组最为突出（P＜0.01）；而PBMC产生IL-4水平有所下降，与PHA单独诱导组相比，除慢性重度乙型肝炎患者组差异有显著性外（P＜0.05），其余两组均无明显差异。

2．4PSP对CHB患者PBMC IFN-γ mRNA表达的影响 从Tab 4和Fig 2可以看出，PSP组CHB患者PBMC IFN-γ mRNA表达量高于PHA组（P＜0.01）。图像分析的结果表明，IFN-γ mRNA／β-actin mRNA灰度积分比值亦呈以上改变。

Fig 1 Effect of PSP on cell cycle of PBMC from patients with chronic hepatitis B virus infection

Tab 3 Effect of PSP on Th1／Th2cytokine concentration in supernatant of PBMC in patients with chronic hepatitis B virus infection（1×10－6mg·L－1，±s，n＝6）

Tab 3 Effect of PSP on Th1／Th2cytokine concentration in supernatant of PBMC in patients with chronic hepatitis B virus infection（1×10－6mg·L－1，±s，n＝6）

A：Normal control group；B：Mide group；C：Moderate group；D：Severe group．＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs normal control；*P＜0.05，**P＜0.01 vs PHA group．

Antigen　Cytokine　A　B　C　D PHA　IFN-γ　4 665．0±164．3　4 347．0±426．0＃　4 088．0±216．6＃＃　3 841．0±181．2＃＃IL-2　242．4±15．9　124．6±12．7＃＃　141．2±13．8＃＃　153．7±16．7＃＃IL-4　168．2±18．7　213．0±19．3＃＃　268．5±13．2＃＃　317．7±17．7＃＃400 mg·L－1PSP　IFN-γ　4 847．0±188．7*　4 674．0±237．2*　4 416．0±143．1＃＃**　4 800．0±218．5**＋PHA　IL-2　265．3±28．7*　138．6±11．1＃＃*　159．8±13．9＃＃**　168．8±13．1＃＃*IL-4　157．3±16．8　200．8±17．8＃＃　260．7±12．8＃＃　295．8±17．1＃＃*

Tab 4 Effect of PSP on mRNA expression level of IFN-γ in supernatant of PBMC in patients with chronic hepatitis B virus infection

3　讨论

Fig 2 Effect of PSP on expression of IFN-γ mRNA in PBMC cul-tural supernatant of patients with chronic hepatitis B virus infection

慢性乙型病毒性肝炎的发病及转归机制十分复杂，与机体的免疫状态有关。免疫中细胞免疫处于核心地位，其免疫病理主要是由T细胞免疫应答状态决定的。在PBMC中富含T细胞，在机体免疫应答中占有重要的地位，同时也是HBV肝外的一个重要靶细胞［4］。Th细胞分为Th1细胞和Th2细胞两种，Th1／Th2细胞的平衡可能决定HBV感染的清除和病变的程度。如果Th1细胞占优势与清除病毒有关，将促进细胞免疫，倾向于发生急性或自限性肝炎；而如果Th2细胞占优势，则将抑制细胞免疫，发生持续性HBV感染［5］。如何增强Th1优势表达，提高细胞毒性T细胞功能是目前治疗CHB主要策略之一。所以用药物刺激机体免疫细胞Th细胞，增强Th1型细胞因子的表达具有重要的意义［6］。

Grzanna等［7］从螺旋藻中提取一种高分子量多糖，能够增强人Th1型细胞中的趋化因子如IL-8、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞趋化蛋白-1等基因的表达水平，同时能够增强IL-1β、TNF-α和环氧化酶2的表达水平。Mao等［8］研究发现，食用以螺旋藻为主的食品添加物能够抑制IL-4的生成，从而调节过敏性鼻炎患者的Th1／Th2细胞平衡。PSP能增强NK细胞活性，刺激T淋巴细胞诱导IFN-γ等的分泌［9］。这些研究表明，PSP能够影响机体的免疫细胞功能，从而调节机体的免疫系统。

螺旋藻在肝肾高脂血症和氧化损伤中具有保护作用［10］。Moura等［11］通过对糖尿病大鼠模型的研究，发现运动和食用螺旋藻相结合可以降低低密度脂蛋白胆固醇和肝脂质水平。Cheong等［12］发现，螺旋藻的摄取能降低高胆固醇血症大白兔模型动脉粥样硬化。Pak等［13］发现，螺旋藻可能通过抗氧化和抗炎症作用机制降低炎症反应。由此可知，螺旋藻在保护肝脏、抗氧化损伤方面具有重要作用［14］。PSP在HepG2．2．15细胞培养中，能够抑制细胞分泌HBsAg和HBeAg，且对HBV-DNA的抑制作用具有明显的剂量关系［15］。PSP在HepG2 2．2．15细胞培养中可明显抑制HBsAg、HBeAg的分泌以及HBV-DNA的合成，具有直接抗HBV作用，提示PSP可与其它抗HBV药物联合用于CHB的治疗［16］。国内外研究表明［17－18］，螺旋藻具有免疫调节、抗病毒、护肝、抗炎、抗氧化、膜稳定性等作用，能够有效稳定慢性肝病患者的病情，在防止慢性肝病患者肝纤维化中起着一定的作用，同时能够防止慢性肝病患者转变为肝硬化。

本实验发现，无论是健康人还是CHB患者，在PHA的协同刺激下，PSP在浓度为50～400 mg· L－1范围能够促进PHA对人PBMC的增殖作用，且促进作用随着药物浓度的增加而增大，但浓度达1 000 mg·L－1时，促进作用有所下降。CHB患者PHA对照组PBMC细胞周期发生G0／G1期向S期转换，与空白对照组相比，差异具有显著性；低、中、高浓度药物诱导组PBMC G0／G1期细胞明显降低，S期细胞明显增加，与PHA对照组相比，差异具有显著性。结果表明PSP对健康人和CHB患者都具有免疫调节作用。

本实验发现，对于正常对照组而言，PHA单独诱导同联合PSP诱导相比，PBMC产生Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2水平明显增高，但产生Th2型细胞因子IL-4水平差异无显著性。与正常对照组相比，CHB患者血清中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ水平相对降低，Th2型细胞因子IL-4水平相对增高，提示患者细胞免疫功能低下，不能有效清除体内的HBV，致使HBV持续感染形成慢性化。对于不同程度的CHB患者，PHA和PSP联合诱导后，PBMC产生IFN-γ水平明显增高，与正常对照组相比差异具有显著性；PBMC产生IL-2水平也明显增高，其中慢性中度乙型肝炎患者组最为突出；而PBMC产生IL-4水平有所下降，与正常对照组相比，除慢性重度乙型肝炎患者组差异有显著性外，其余两组均无差异。

本实验还通过采用RT-PCR检测PSP与PHA 对CHB患者PBMC细胞因子IFN-γ mRNA表达的影响，结果表明，PSP能在转录水平上提高CHB患者PBMC IFN-γ mRNA的表达水平。由此可见，PSP的免疫调节作用与其在转录水平上促进IFN-γ mR-NA的表达是分不开的，这可能也是PSP发挥免疫调节与抗病毒作用的重要机制之一。

综上所述，PSP与PHA一同诱导CHB患者PB-MC时，促进机体免疫细胞增殖，调节细胞周期的进程，可使抗原PHA活化PBMC产生IFN-γ和IL-2的水平增高，产生IL-4的水平下降，而且能提高细胞因子IFN-γ mRNA的表达水平，表明PSP可以增强PHA的Th1细胞应答能力，促进Th0向Th1的转化，同时对Th2的形成有一定的抑制作用，在恢复Th1／Th2细胞平衡中起到一定的作用。

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The immunoregulative action of polysacchrides of Spirulina platensis in peripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis B virus infection

LYU Xiao-hua1，CHEN Wen-qing2，LUO Shi-ying1，WU Tie1，LYU Shi-jing2
（1．Dept of Pharmacology，2．Institute of Laboratory Medicine，Guangdong Medical University，Zhanjiang Guangdong 524023，China）

Abstract：Aim To investigate the immunoregulative action of polysacchrides of Spirulina platensis（PSP）on peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in pa-tients with chronic hepatitis B virus infection．Meth-ods Proliferation and cycle of PBMCs from patients with chronic hepatitis B virus infection were measured by MTT colorimetry and flow cytometry respectively．The concentration of IFN-γ，IL-2，IL-4 in supernatants of PBMCs were examined by ELISA．The mRNA ex-pression of IFN-γ in PBMCs from patients with chronic hepatitis B virus infection was detected by RT-PCR．Results PSP could induce proliferation of PBMCs in patients with chronic hepatitis B virus infection．In ad-dition，PSP could increase the protein expression of IFN-γ and IL-2 in supernatants of PBMCs in patients with chronic hepatitis B virus infection，and PSP could also enhance the mRNA expression of IFN-γ of PBMCs in patients with chronic hepatitis B virus infection．However，PSP inhibited the protein expression of IL-4 of PBMCs in patients with chronic hepatitis B virus in-fection．Conclusion PSP can promote the immune function and plays an important immunoregulation function on patients with chronic hepatitis B virus in-fection．

Key words：polysacchrides of Spirulina platensis；chronic hepatitis B；peripheral blood mononuclear cells；interferon；interleukin-2；interleukin-4

作者简介：吕小华（1976－），女，硕士，副教授，研究方向：抗炎免疫药理学，Tel：0759-2388588，E-mail：30817916＠qq．com；吕世静（1949－），男，教授，硕士生导师，研究方向：免疫学，通讯作者，E-mail：sjlujyx＠126．com

基金项目：广东省社会发展领域科技计划项目（No 73043）；湛江市财政资金科技专项备用经费资助项目（No 2014C01032）；广东医学院面上项目（No M2012013）

收稿日期：2015－04－07，修回日期：2015－04－27

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）08－1121－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．019