人C1q／TNFα相关蛋白-6的表达、纯化及生物活性分析

李洪波，高学飞，李 娜，吴东海

（1．怀化学院生命科学系，民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418008；2．中国科学院广州生物医药与健康研究院，广东广州 510530）

人C1q／TNFα相关蛋白-6的表达、纯化及生物活性分析

李洪波1，2，高学飞2，李 娜2，吴东海2

（1．怀化学院生命科学系，民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418008；2．中国科学院广州生物医药与健康研究院，广东广州 510530）

中国图书分类号：R-332；R378.21；R341；R394.2；R977．6

摘要：目的 利用大肠杆菌表达可溶性hCTRP6蛋白并分析其活性。方法 重组载体转化大肠杆菌表达菌株、IPTG诱导表达、纯化后测定活性。结果 Trx-hCTRP6蛋白在大肠杆菌中高效表达，经镍亲合纯化和分子筛纯化，Trx-hCTRP6在细胞和动物水平上都有生物活性。结论 利用大肠杆菌表达系统高效制备了具有生物活性的Trx-hCTRP6蛋白。

关键词：C1q／TNFα相关蛋白-6；大肠杆菌；重组蛋白；亲合纯化；蛋白印迹；分子筛

网络出版时间：2015－7－22 10：42 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．030．html

C1q／肿瘤坏死因子相关蛋白（C1q and tumor necrosis factor related proteins，CTRPs）是一类在结构和功能上与脂联素类似的蛋白［1－5］。所有CTRPs蛋白都以三聚体作为分泌的基本结构单元，可以形成6聚体、12聚体、18聚体以及更高形式的多聚体；CTRP3、CTRP5、CTRP6和CTRP10的三聚体通过二硫键进一步聚集成更有序的低聚物；除了形成同源低聚物，CTRP1／CTRP6、CTRP2／CTRP7和脂联素／CTRP2可以作为异源低聚体分泌［1－5］。不同CTRPs间的生物功能各异，例如：CTRP1特异性结合胶原纤维并阻断胶原介导的血小板聚集，阻止血栓形成，且具有降血糖功能，能增加胰岛素敏感性等；CTRP2球状结构域具有增加肝脏糖原合成、促进脂肪酸的氧化及胰岛素增敏作用；CTRP-3能够抑制趋化因子的释放，CTRP5在眼部发育过程中起一定的作用，CTRP11与脂肪形成有关，CTRP13激活AMP的磷酸化并参与脂肪酸的代谢调节［2－5］。CTRP6可以诱导巨噬细胞白细胞介素-10（IL-10）的表达。CTRP6球状区（gCTRP6）剂量依赖性地增加IL-10的表达水平，并且gCTRP6可以迅速诱导ERK1／2的磷酸化。使用选择性抑制剂U0126后，CTRP6诱导的IL-10表达被阻断。由于IL-10是一个有效的抗炎细胞因子，可以调节炎症信号通路，所以CTRP6可能是一个抗炎药物的新靶点；另外，CTRP6球状区可以在骨骼肌细胞中调节磷酸化并激活AMPK。在肌细胞中，CTRP6诱导乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的磷酸化和脂肪酸氧化，CTRP6在能量代谢中可能具有重要功能［1，6－7］。本研究将以大肠杆菌为宿主菌，制备重组hCTRP6蛋白，在动物和细胞水平上分析能量代谢调节活性。

1　材料

表达菌株BL21-codonplus（DE3）、表达载体pET32a（＋）购自Invitrogen公司。镍亲和层析树脂购自Qiagen公司，分子筛Sephadex G-75购自于GE公司，p-AMPKα、AMPKα及β-actin抗体购自CST公司（Cell Signaling Technology，Inc）。8周龄的C57BL／6♂小鼠由中国科学院广州生物医药与健康研究院实验动物中心饲养。各种工具酶为TaKa-Ra公司产品，PCR引物由Invitrogen合成，一般化学试剂为Sigma分析纯。

2　方法

2．1表达载体构建及表达产物的验证 上游引物PF：5′-GCCCATGGCCTTTGACAGAGCTGTG-3′（CCA TGG NcoI位点）；下游引物PR：5′-CGCTCGAG-GTCGTCCTCGGCCTTGATG-3′（CTCGAG XhoI位点）；以从北京义翘神州生物技术有限公司（Sino Bi-ological Inc．）购买hCTRP6的cDNA为模板，PCR扩增目标片段、构建重组载体pET32／hCTRP6并转化入大肠杆菌BL21-codonplus（DE3）菌株。随机挑取5个转化子单菌落，接种至20 mL含50 mg·L－1Amp LB液体培养基的50 mL三角瓶中，37℃、250 r ·min－1培养至A600＝0.6～0.8，加入终浓度0.1 mmol·L－1IPTG，20℃诱导5 h，取菌液2 mL，离心得菌体，向菌体中加入PBS溶液（1%曲拉通X-100、3 mmol·L－1PMSF）200 μL，超声破碎，离心取上清，加入上样缓冲液，热变性后SDS-PAGE分析。

2．2重组蛋白纯化 取过夜培养种子菌2 mL，接种至200 mL LB（含50 mg·L－1Amp）培养基中，37℃、250 r·min－1培养至A600＝0.6～0.8，于20℃诱导8 h，离心取菌体。镍亲合纯化参照精编分子生物学实验指南和文献进行［8－12］。将镍亲合纯化后的蛋白利用曲拉通X-114去除内毒素并超滤浓缩，Superdex G-75分子筛进行纯化，具体步骤参照文献进行［8，12］。取不同咪唑浓度的蛋白洗脱液和经分子筛纯化收集的蛋白，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液、经煮沸变性后，12%SDS-PAGE分析纯化情况，纯化蛋白利用兔抗His×6抗体蛋白印迹分析。Trx（硫氧还蛋白）的表达与纯化参照文献进行［8］。

2．3重组蛋白活性分析 小鼠肌管前体细胞C2C12分化为肌管细胞参照文献进行［8］。分化细胞无血清DMEM饥饿12 h，加入终浓度为2 mg· L－1Trx-hCTRP6蛋白温育不同时间，用含蛋白磷酸化酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解细胞，离心收集蛋白上清、BCA法测定浓度、12%SDS-PAGE分离蛋白、转膜并利用相应抗体进行Western blot分析。

C57BL／6小鼠于中科院广州生物医药与健康研究院动物中心饲养，实验操作严格按照动物委员会的相关规定开展。实验小鼠在实验前先测定其基础血糖浓度；之后，按2 μg·g－1体重腹腔注射经6 h饥饿的6周龄♂小鼠，腹腔注射9只，尾静脉取血10 μL，测定注射后0、1、2、3、4、5及6 h的血糖浓度；同时，设注射Trx的对照实验小鼠8只，腹腔注射与注射hCTRP6组等体积的Trx（2 μg·g－1体重）作为对照。

3　结果

3．1表达产物验证 挑取pET32／hCTRP6重组载体的大肠杆菌BL21转化子数个，于IPTG诱导前后分别提取可溶性总蛋白，蛋白质的SDS-PAGE分析结果如Fig 1所示。未经IPTG诱导的转化子（泳道5）在50 ku左右没有特异表达产物，而4株经IPTG诱导的BL21转化子（泳道1－4）在50 ku左右有明显的蛋白表达（箭头所示），hCTRP6蛋白理论分子质量约30 ku，其N-端融合了Trx片段（理论分子质量约20 ku），hCTRP6全长蛋白与Trx融合蛋白的表达产物理论分子质量大小约50 ku，该蛋白的分子质量大小与预期分子质量相符，说明实现了重组Trx-hCTRP6蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。

Fig 1 SDS-PAGE identification of soluble expression of Trx-hCTRP6

3．2重组蛋白的纯化 SDS-PAGE分析结果表明，含100、200及300 mmol·L－1咪唑的洗脱缓冲液能将目标蛋白从树脂上洗脱，当咪唑为300 mmol· L－1时，目标蛋白的纯度最高（Fig 2A）。纯化结果说明，利用镍亲合层析可以对Trx-hCTRP6蛋白有效纯化。将300 mmol·L－1咪唑洗脱的蛋白样品收集，利用曲拉通X-114除去内毒素后将蛋白于PBS中透析后超滤浓缩，Sephadex G-75分子筛对重组蛋白进一步纯化，分子筛纯化蛋白SDS-PAGE结果如Fig 2B所示，从Fig 2B可看出，经分子筛后收集的样品5和6纯度最高，SDS-PAGE结果中看不到杂蛋白条带。将收集的样品5和6合并后超滤浓缩，分别取10和1 μg进行SDS-PAGE及Western blot分析，结果如Fig 2C所示，纯化的样品具有很高的纯度，在目标位置的印迹条带明显。

3．3活性分析 纯化的Trx-hCTRP6经刺激C2C12分化肌管细胞。蛋白印迹分析信号转导相关蛋白磷酸化变化情况，结果显示，Trx-hCTRP6能激活AMPKα的磷酸化，Trx蛋白不能激活AMPKα的磷酸化。AMPKα的磷酸化结果如Fig 3A所示，经2 mg·L－1的hCTRP6刺激10 min，AMPKα的磷酸化程度增加；当Trx-hCTRP6刺激超过20 min，AMPKα磷酸化的增加更趋于明显。以上蛋白印迹结果表明，大肠杆菌表达的Trx-hCTRP6具有生物活性。

Fig 2 Purification of fusion recombinant protein of Trx-hCTRP6

降血糖活性测定结果表明：在注射前和注射重组蛋白1～2 h内，两组小鼠的血糖水平没有明显差异；在注射3～4 h内，注射Trx-hCTRP6的实验组小鼠的血糖要低于注射Trx的对照小鼠，两者之间存在明显差异；但注射4 h后，两实验组小鼠的血糖浓度间的差异消失（Fig 3B）。动物实验结果进一步证明，利用大肠杆菌表达纯化的Trx-hCTRP6具有生物活性。

4　讨论

目前，已成功克隆到至少15个高度同源的脂联素类似物，虽然CTRPs在结构上具有相似性，但是它们参与的生理过程存在明显差异［1－5］。越来越多研究表明，CTRPs除参调节能量代谢外，在心血管疾病中也发挥重要生理功能。例如：CTRP9通过激活AMPK信号通路改善心肌缺血／再灌注损伤肥胖所致的脂肪细胞因子产生失衡是心血管疾病发病的一个重要原因；CTRP6在颈动脉球囊拉伤处高表达，过表达CTRP6进一步促进球囊拉伤处血管内膜增生等。

Fig 3 Biological activity assays of purified fusion recombinant protein Trx-hCTRP6

本研究主要目的在于制备活性CTRP6重组蛋白。我们已经制备了具有生物活性的CTRP1和 2全长及球状功能区蛋白，与CTRP1和2重组蛋白相比较，Trx-hCTRP6有激活AMP磷酸化的作用，但在检测动物水平的降血糖活性时，Trx-hCTRP6蛋白在注射3 h后呈现出降血糖活性，降血糖活性仅能维持至注射后4 h。之前表达的CTRP1和2或其球状功能区，降血糖活性在注射1 h后与对照组有明显差异，在注射2 h后差异更为明显，并且其降血糖活性至少维持5 h以上［8－11］。因此，相比较CTRP1 和2，Trx-CTRP6的降血糖活性明显低于它们，这也意味着不同CTRP之间的降血糖效应存在差异。总之，本研究为hCTRP6蛋白的可溶和活性表达找到了一种有效方法，为该蛋白的应用及机制研究奠定了基础。

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Expression，purification and biological activities assay of human C1q and tumor necrosis factor related protein-6

LI Hong-bo1，2，GAO Xue-fei2，LI Na2，WU Dong-hai2
（1．Dept of Life Sciences，Huaihua College，Huaihua Hunan 418008，China；2．Guangzhou Institute of Biomedicine and Health，CAS，Guangzhou 510530，China）

Abstract：Aim To prepare soluble human C1q and tumor necrosis factor related protein-6 in Escherichia coli and analyze the bioactivity．Methods Recombi-nant plasmid was transformed into E．coli expression strain，and the recombinant protein Trx-hCTRP6 was expressed induced by IPTG and then purified．Results

Trx-hCTRP6 was expressed efficiently and purified using Ni-NTA affinity chromatography and Superdex G- 75 column．The purified Trx-hCTRP6 was shown to be active under in vivo and in vitro assay conditions．Con-clusion Active Trx-hCTRP6 is efficiently prepared from E．coli protein expression system．

Key words：C1q and tumor necrosis factor related pro-tein-6；Escherichia coli；recombinant protein；affinity purification；Western blot；gel filtration chromatogra-phy

作者简介：李洪波（1980－），男，博士，副教授，研究方向：生物制药及生物化学与分子生物学，通讯作者，E-mail：lihong-bo8007＠163．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81300655）；湖南省重点学科建设项目（No 2011042）；广东省科技计划项目（No 2013B051000090）

收稿日期：2015－03－12，修回日期：2015－04－14

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）08－1165－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．027