黄芪甲苷对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌细胞PGC-1α 和NRF-1表达的影响

曹琼丹，杨育红，于胜男，鲁美丽，张素萍，韩镕徽，胡 进

（辽宁医学院心脑血管药物研究重点实验室，辽宁锦州 121001）

黄芪甲苷对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌细胞PGC-1α 和NRF-1表达的影响

曹琼丹，杨育红，于胜男，鲁美丽，张素萍，韩镕徽，胡 进

（辽宁医学院心脑血管药物研究重点实验室，辽宁锦州 121001）

中国图书分类号：R-332；R284．1；R329．24；R329.411；R587.102.2

摘要：目的 探讨黄芪甲苷（ASIV）对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠心肌细胞能量代谢及线粒体合成的影响。方法 50只6周龄的SD大鼠，分为5组，每组10只，分别是空白组、模型组、ASIV 10、20、40 mg·kg－1组。除空白组，其余40只尾静脉注射STZ（35 mg·kg－1）建立Ⅰ型糖尿病心肌病模型。连续给药16周后，检测其左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张期末压（LVEDP）、左心室最大上升／下降速率（±dp／dtmax），苏木精－伊红（HE）染色观察心肌病理切片。ELISA检测心肌组织中ATP、ADP、AMP的含量。Western blot法检测心肌组织中过氧化体增殖物激活型受体γ共激活因子1α（PGC-1α）和核呼吸因子（NRF-1）蛋白表达，RT-PCR检测心肌组织中PGC-1α和NRF-1 mRNA的表达。结果 与空白组相比，模型组大鼠的LVEDP上升，LVSP、±dp／dtmax下降，ATP／ADP、ATP／AMP比值均下降。与模型组相比，黄芪甲苷低剂量组变化不明显，中、高剂量组LV-EDP下降，LVSP、±dp／dtmax上升，ATP／ADP、ATP／AMP比值均上升，PGC-1α与NRF-1的蛋白表达和mRNA表达均增加，有一定的剂量依赖性。结论 黄芪甲苷通过提高PGC-1α和NRF-1的表达促进Ⅰ型糖尿病大鼠心肌细胞内线粒体的生物合成，提高能量代谢。

关键词：黄芪甲苷；糖尿病心肌病；PGC-1α；NRF-1；线粒体；能量代谢

网络出版时间：2015－7－22 10：42 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．017．html

糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病。Ⅰ型糖尿病病人胰岛素分泌下降，致使体内葡萄糖大量堆积无法利用。心脏作为一个高耗能的器官，需要大量ATP维持其正常的运作，主要由线粒体提供。过氧化体增殖物激活型受体γ共激活因子1α（PGC-1α）是线粒体生成的关键调控因子［1－3］，可增强核受体及相关转录蛋白的转录活性，刺激线粒体合成和呼吸的发生［4］。近年来研究显示，在多种糖尿病并发症中发现了PGC-1α表达的下调［5］，同时影响下游的核呼吸因子NRF-1的表达，致使线粒体生物合成受损，线粒体功能障碍，这可能是糖尿病并发症发病的重要机制之一。黄芪甲苷（ASIV）具有广泛的药理作用，对心肌细胞具有保护作用［6］。本实验主要研究ASIV能否通过PGC-1α来提高糖尿病大鼠心肌细胞能量代谢，从而为糖尿病心肌病提供新的治疗方案

1　材料与仪器

1．1药物与试剂 黄芪甲苷（纯度0.98，南京景竹生物科技有限公司），羧甲基纤维素钠CMC、链脲佐菌素STZ（美国Sigma公司），ATP、ADP、AMP ELISA试剂盒（R＆D公司），PGC-1α、NRF-1抗体（Abcam公司），TRIzol试剂、RT-PCR试剂盒（北京鼎国），其他试剂均为国产分析纯。

1．2动物 ♂Sprague-Dawley（SD）大鼠，6周龄，体质量（200±20）g，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2009－0004。实验室温度（22±2）℃，湿度45%～65%，适宜通风，每天12 h光照，正常饮水、进食。

1．3仪器 BL-420四道生理记录仪，成都泰盟科技有限公司；DNM-9602G酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司；Onetouch II血糖仪，美国强生公司；RM2235型石蜡切片机；Leica DM 1000光学显微镜，德国Leica公司；凝胶成像仪、电泳仪、电泳槽、PCR仪，美国Bio-Rad公司；核酸蛋白分析仪，德国Ep-pendorf公司。

2　方法

2．1糖尿病模型制备 用0.1 mol·L－1的枸橼酸缓冲液（pH＝4.2）在冰浴中配制为10 g·L－1的STZ溶液，现配现用，禁食8 h后的大鼠尾静脉注射STZ（35 mg·kg－1）。注射完7 d后空腹测血糖，若血糖大于16.7 mmol·L－1，且有多饮、多食、多尿现象者，确定为糖尿病大鼠。本实验均造模成功。

2．2实验动物分组与处理 随机选择10只健康♂SD大鼠作为空白组，40只造模成功的糖尿病大鼠随机分为4组，分别为模型组、黄芪甲苷高、中、低剂量治疗组。黄芪甲苷用1%的羧甲基纤维素钠助溶。各治疗组分别以每日40、20、10 mg·kg－1的ASIV剂量灌胃1次。空白组和模型组，每日以等体积1%羧甲基纤维素钠灌胃1次。于给药16周末，空腹8h后麻醉，右颈动脉插管测血流动力学指标，腹主动脉取血，开胸取心脏，一部分用4%多聚甲醛固定，用于HE染色；另一部分冻存－80℃冰箱，用于RT-PCR和Western blot检测。

2．3血流动力学测定 大鼠腹腔注射水合氯醛（45 mg·kg－1）麻醉后仰位固定，分离右侧颈总动脉，由颈总动脉插管至左心室，采用BL-420四道生理记录仪对左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒张期末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室最大上升／下降速率（±dp／dtmax）进行记录。

2．4心肌组织结构观察 4%多聚甲醛固定心肌组织24 h后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备4 μm石蜡切片，常规HE染色，中性树脂封片，光镜显微镜（×400）下观察分析心肌组织病理变化。

2．5ELISA试剂盒检测心肌组织ATP、AMP、ADP的含量 剪取体积约2 mm3的心肌组织，加入1 mL RIPA裂解液，匀浆器匀浆后，4℃12 000 r· min－1离心10 min，取上清，按ELISA试剂盒说明书操作，450 nm波长下检测OD值，绘制标准曲线，计算各组心肌组织ATP、ADP、AMP含量，计算ATP／ADP、ATP／AMP的值。

2．6Western blot检测PGC-1α和NRF-1蛋白表达 从－80℃冰箱取100 mg冻存的心肌组织，加入1 mL RIPA裂解液（含1 mmol·L－1的PMSF），快速匀浆后用超声波粉碎仪粉碎30 s，冰上静置30 min后，4℃16 000 r·min－1离心15 min，取上清。用BCA法进行蛋白含量测定，调整蛋白浓度至1 g ·L－1。根据所需样品体积，加5×SDS上样缓冲液，98℃加热10 min，使蛋白变性。灌胶上样进行SDS-PAGE电泳。取出凝胶转移至PVDF膜，封闭，加入一抗4℃孵育，过夜。加入二抗，室温孵育1 h，冲洗后，ECL显色，定影。凝胶图像处理系统分析目标条带的分子量和净光密度值。

2．7RT-PCR检测PGC-1α和NRF-1 mRNA的表达 取冻存的心肌组织约100 mg，加1 mL TRIzol，按试剂盒操作，提取总RNA。用酶标仪鉴定RNA纯度和浓度。每个样品的上样量为500 ng，按试剂盒说明书进行操作。引物序列如Tab 1所示。反转录，45℃，30 min；预变性，95℃，5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环；终延伸，72℃，5 min。取产物9 μL，加1 μL 10×上样缓冲液，在2%的琼脂糖凝胶中电泳40 min，在凝胶成像仪上照相观察，对实验结果进行分析处理。

Tab 1 Specific primer sequences for RT-PCR

2．8统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据以±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组内两两比较采用LSD法。

3　结果

3．1血流动力学参数变化 由Tab 2可见，与空白组相比，模型组LVEDP明显升高，而LVSP、±dp／dtmax明显降低（P＜0.01），表示模型组大鼠心脏舒缩功能不全；与模型组相比，ASIV中、高剂量组对左心功能的改善效果明显，LVSP、±dp／dtmax上升，LVEDP下降（P＜0.01），并存在剂量依赖性。而ASIV低剂量组改善心功能症状不明显。

Tab 2 Effects of ASIV on hemodynamics in diabetic cardiomyopathy rats（±s，n＝10）

Tab 2 Effects of ASIV on hemodynamics in diabetic cardiomyopathy rats（±s，n＝10）

**P＜0．01 vs control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs model group

Group　LVEDP／kPa　LVSP／kPa　＋dp／dtmax／kPa·s－1　　－dp／dtmax／kPa·s－1Control　0．78±0．10　15．43±1．21　353．61±21．65　292．08±15．89 Model　2．17±0．37**　8．86±1．13**　202．61±18．40**　158．32±14．71**ASIV 10 mg·kg－1　2．12±0．29　10．28±1．80＃　231．25±14．50＃　201．68±14．70＃＃ASIV 20 mg·kg－1　1．68±0．29＃＃　12．92±1．29＃＃　276．28±16．84＃＃　223．70±10．05＃＃ASIV 40 mg·kg－1　1．25±0．22＃＃　13．84±1．42＃＃　280．39±26．12＃＃　262．15±16．78＃＃

3．2心肌组织结构改变 在显微镜下观察心肌组织HE染色切片，空白组心肌细胞排列整齐，形态清晰；模型组心肌细胞形态紊乱，结构模糊，有大量炎细胞浸润；与模型组相比，治疗组随药物剂量增大，细胞间隙逐渐减小，间质依次减少，排列较整齐，形态逐渐均匀（Fig 1）。

Fig 1 Groups of rats myocardial morphology observation（HE× 400）

3．3心肌组织中ATP／ADP、ATP／AMP比值变化

用ELISA法检测心肌组织中ATP、ADP和AMP的含量，并求ATP／ADP、ATP／AMP比值。由Tab 3可见，与空白组相比，模型组ATP／ADP、ATP／AMP比值明显下降（P＜0.01）；与模型组相比，治疗组的ATP／ADP、ATP／AMP比值均上升，其中中、高剂量组的比值上升明显（P＜0.01），且呈剂量依赖。说明黄芪甲苷能够改善心肌能量代谢。

Tab 3 Effects of ASIV on ATP／ADP and ATP／AMP ratio in diabetic cardiomyopathy rats（±s，n＝10）

Tab 3 Effects of ASIV on ATP／ADP and ATP／AMP ratio in diabetic cardiomyopathy rats（±s，n＝10）

**P＜0．01 vs control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs model group

Group　ATP／ADP　ATP／AMP Control　2．30±0．40　8．88±2．00 Model　0．43±0．25**　2．65±0．78**ASIV 10 mg·kg－1　0．76±0．24＃　3．95±1．42＃ASIV 20 mg·kg－1　1．03±0．25＃＃　4．22±0．99＃＃ASIV 40 mg·kg－1　1．55±0．23＃＃　5．54±1．36＃＃

3．4Western blot法检测心肌组织中PGC-1α和NRF-1蛋白表达变化 与空白组相比，模型组PGC-1α和NRF-1蛋白的表达明显降低；与模型组相比，ASIV低、中、高剂量组干预后，PGC-1α和NRF-1蛋白表达明显升高，且呈剂量依赖性。说明黄芪甲苷可能通过PGC-1α这一路径干预糖尿病心肌病的能量代谢，保护受损的心肌细胞（Fig 2）。

Fig 2 Effects of ASIV on PGC-1α and NRF-1 protein expressions in myocardial tissue of rats（±s，n＝10）

3．5RT-PCR法检测心肌组织中PGC-1α和NRF-1 mRNA表达变化 如Fig 3所示，与空白组相比，模型组的PGC-1α和NRF-1 mRNA表达下降；与模型组比较，低、中、高治疗组随药物剂量的提高，PGC-1α和NRF-1 mRNA表达逐渐增多，进一步说明黄芪甲苷可能通过PGC-1α途径改善糖尿病大鼠的心肌组织，提高能量代谢，促进心肌细胞线粒体的生物合成。

4　讨论

线粒体在细胞中至关重要，它是为细胞供能的主要场所，它参与细胞从生长到凋亡的整个能量代谢过程。当线粒体生成障碍时，会直接影响线粒体的功能状态，而线粒体功能状态又与心血管疾病的发生发展关系密切。线粒体的生物合成是由线粒体基因和细胞核基因共同作用的，由于线粒体自身合成相关蛋白的能力有限，故线粒体的生物合成主要依赖于核基因［7］。PGC-1α作为主要的辅激活因子，在线粒体生物合成的调控中起到中心作用［8］。在心肌组织中，含量丰富的PGC-1α能够强烈刺激下游核转录因子如线粒体转录因子A（TFAM）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和核呼吸因子（NRFs）等［9］，影响线粒体的生成，参与能量代谢的调控［10］。其中NRFs是调控线粒体生物合成最主要的转录因子。NRFs家族包括NRF-1和NRF-2，其中NRF-1的作用更为重要［11］。PGC-1α可强烈诱导下游NRF-1的表达，促进NRF-1的基因转录［12］。核转录因子NRF-1可促进线粒体氧化磷酸化，转录调控呼吸酶相关的细胞核基因，影响线粒体基因组的复制、转录、相关蛋白的表达等［13］。

Fig 3 Effects of ASIV on PGC-1α and NRF-1 mRNA expressions in myocardial tissue of rats（±s，n＝10）

本实验结果显示，连续喂养16周的糖尿病大鼠，与空白组相比，LVEDP上升，LVSP下降，±dp／dtmax也下降，HE心肌病理切片显示炎症细胞浸润聚集，心肌细胞结构紊乱，说明糖尿病大鼠存在明显的心肌病变，糖尿病心肌病大鼠造模成功。ELISA法检测ATP、AMP、ADP的含量，模型组大鼠ATP／AMP、ATP／ADP比值明显下降，证明心肌细胞供能减少，推测糖尿病心肌病可能与线粒体合成受损有关。Western blot和RT-PCR结果显示，与空白组相比，模型组大鼠心肌细胞PGC-1α和NRF-1的蛋白表达和mRNA表达均减少。进一步验证，在I型糖尿病中，PGC-1α、NRF-1与糖尿病大鼠心肌细胞中线粒体合成的内在联系。在大鼠心肌组织中，PGC-1α、NRF-1的表达减弱，线粒体生物合成受阻，功能受损，ATP合成减少，能量供应不足，出现代谢障碍。

黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，可增强心肌收缩力，改善心肌能量代谢，抑制心室肥厚、心肌纤维化及心肌凋亡，保护血管内皮细胞，减轻血管张力，降血压，对心血管的保护作用十分明显［6］。本实验室先前研究表明，黄芪甲苷可通过PGC-1α途径提高能量代谢来改善异丙肾上腺素诱导的大鼠的心肌肥厚症状［14］。糖尿病心肌病作为糖尿病的主要致死原因之一，其治疗药物一直是人们的研究热点。近年来，大量实验证明黄芪甲苷可降低血糖、血脂，抗炎症，抗氧化［15］，刺激胰岛素的产生［16］，对糖尿病及其并发症具有保护作用。而黄芪甲苷究竟是通过何种机制作用于糖尿病，目前尚不明确。本实验结果显示，与模型组相比，黄芪甲苷干预治疗后，LVEDP、LVSP、±dp／dtmax等血流动力学指标，HE病理染色均有所改善，大鼠ATP／AMP、ATP／ADP比值上升，PGC-1α和NRF-1的蛋白表达和mRNA表达均增加。由实验结果推测，黄芪甲苷可能通过PGC-1α路径激活下游的重要作用靶点核呼吸因子NFR-1，而NRF-1又进一步活化TFAM等线粒体相关因子，从而促进线粒体的生物合成和能量代谢，保护心肌，改善心脏功能障碍。

本实验表明，黄芪甲苷可通过PGC-1α路径来调控线粒体的代谢与合成，改善糖尿病心肌病的症状，但黄芪甲苷对NRF-1下游的具体作用机制还需进一步探索。综上所述，Ⅰ型糖尿病心肌病大鼠心脏功能障碍，能量代谢调节能力下降，线粒体合成受阻，黄芪甲苷作为一种改善心肌症状的有效药物，为临床上治疗糖尿病心肌病提供了新的思路。

（致谢：本实验于辽宁医学院心脑血管药物研究重点实验室完成，感谢该实验室诸位老师的悉心指导和同学们的大力帮助。）

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Effect of astragaloside IV on expression of PGC-1α and NRF-1 in myocardial cells of typeⅠdiabetic rat

CAO Qiong-dan，YANG Yu-hong，YU Sheng-nan，LU Mei-li，ZHANG Su-ping，HAN Rong-hui，HU Jin
（Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular Drug Research of Liaoning Province，Drug Research Institute，Liaoning Medical University，Jinzhou Liaoning 121001，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of astragalo-side IV（ASIV）on myocardial energy metabolism and mitochondrial biosynthesis in myocardial cells of dia-betic rats induced by streptozotocin（STZ）．Methods 50 SD rats at 6 weeks of age were assigned to 5 groups，10 for each group：control group，model group，ASIV 10 mg·kg－1·d－1group，ASIV 20 mg·kg－1·d－1group，ASIV 40 mg·kg－1·d－1group．Except the control group，the remaining 40 were used to estab-lish type 1 diabetes model by the tail vein injection ofbook=1101,ebook=70STZ（35 mg·kg－1）．At the end of 16 weeks of treat-ment，left ventricular systolic pressure（LVSP），left ventricular diastolic final pressure（LVEDP）and left ventricular maximum rising／falling rate（±dp／dtmax）were tested．Pathological section was observed by HE staining．ATP，ADP，AMP levels were detected by ELISA．The expressions of PGC-1α and NRF-1 protein were assessed by Western blot．The expressions of PGC-1α and NRF-1 mRNA were determined by RT-PCR．Results Compared with control group，model group markedly elevated LVEDP and decreased LVSP，±dp／dtmax，ATP／AMP and ATP／ADP ratio．Com- pared with model group，low-dose ASIV group did not change significantly，middle-dose ASIV group and high-dose ASIV group obviously decreased LVEDP，and im-proved LVSP，±dp／dtmax，ATP／ADP and ATP／AMP ratio．Meanwhile，the expressions of PGC-1α and NRF-1 protein and mRNA were increased in a dose-de-pendent manner．Conclusion ASIV could promote mitochondrial biosynthesis，improve energy metabolism in myocardial cells of type 1 diabetic rats by PGC-1α and NRF-1．

Key words：astragaloside IV；diabetic cardiomyopa-thy；PGC-1α；NRF-1；mitochondria；energy metabolism

作者简介：曹琼丹（1990－），女，硕士，研究方向：心血管药理学，E-mail：cobra1129＠163．com；杨育红（1967－），女，博士，教授，研究方向：心血管药理学，通讯作者，E-mail：jzwangpeixun＠163．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81374008）

收稿日期：2015－03－26，修回日期：2015－04－29

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）08－1096－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．014