六味地黄汤辅助环磷酰胺对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB表达的影响*

★　饶斌　谢斌　谢雄　余功　刘红宁　(江西中医药大学　南昌 330004)

*基金项目：国家自然科学基金项目(81260523)；江西省研究生创新基金项目(YC2014-S275)；江西中医药大学研究生创新基金项目(JZYC14A02)。

六味地黄汤辅助环磷酰胺对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB表达的影响*

★饶斌*第一作者：饶斌，硕士研究生。研究方向：中医药抗肿瘤。E-mail:837585272@qq.com。谢斌谢雄余功刘红宁*通信作者：刘红宁，教授，博士生导师。研究方向：中医基础理论。E-mail:lhongnin@yahoo.com.cn。(江西中医药大学南昌 330004)

*基金项目：国家自然科学基金项目(81260523)；江西省研究生创新基金项目(YC2014-S275)；江西中医药大学研究生创新基金项目(JZYC14A02)。

摘要：目的：观察六味地黄汤辅助环磷酰胺对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB表达的影响。方法：雄性昆明小鼠40只，随机分为模型组、化疗组、六味组、六味化疗组，每组10只。腋下注射H22细胞建立H22荷瘤模型，六味组造模前两周开始用药(剂量为22g/kg·d)，化疗组(剂量为50mg/kg·d,隔日1次)及六味化疗组造模后用药，造模14d后处死小鼠称重，取瘤组织称重计算抑瘤率，取脾组织称重计算脾指数，免疫组化检测MMP9、NF-kB蛋白的表达。结果：化疗组及六味化疗联合组具有明显的抑瘤作用，与模型组比较有统计学意义(P<0.01)，与六味组比较，有统计学意义(P<0.05)；六味组脾指数增大，与模型组及化疗组比较，均有统计学意义(P<0.05)，六味化疗联合组的脾指数均高于化疗组，有显著性差异(P<0.01)；与模型组比较六味化疗联合组MMP9蛋白表达水平显著下降(P<0.05)，六味、化疗、六味化疗联合均可显著降低NF-kB蛋白的表达水平，与模型组比较，有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：六味地黄汤辅助环磷酰胺可提高动物免疫功能，其抗肝癌的协同机制可能不是通过NF-KB，而是通过降低肝癌组织MMP9蛋白表达来实现。

关键词：六味地黄汤；环磷酰胺；肝癌；MMP9；NF-KB

肝癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不降，如何提高肝癌的临床治疗效果是当今医学领域迫切需要解决的重大课题之一。六味地黄汤是中医滋阴经典方剂，其可通过增强免疫、增强抑癌基因表达、改善细胞间的物质信息通讯、防止致癌物所致突变和癌变、对增殖及转移影响、对血管生成的影响等方面而发挥预防、治疗及辅助治疗肿瘤的疗效[1]。然而在现有的报道中其之于肝癌的治疗多处于辅助增效的地位[2-3]，因此将六味地黄汤引用到与化疗药物联用治疗肝癌中，并探讨其联用机理对于该方在肝癌临床上的推广使用具有一定的意义。环磷酰胺是广谱抗肿瘤药，临床上广泛用于肝癌及其他各种肿瘤的治疗。故本研究拟观察六味地黄汤联合环磷酰胺对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB表达的影响，探讨该方辅助化疗药物抗肝癌的治疗机制。

1材料和方法

1.1动物及瘤株动物：SPF级雄性KM小鼠,体重20±2g,江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(赣)2011-0001。

瘤株：小鼠H22肝癌细胞来源：中国医学科学院肿瘤细胞库提供。

1.2药物及制备六味地黄汤：熟地15g，山茱萸12g，山药12g，丹皮10g，泽泻10g，茯苓10g(购自江西省中医院中药房)。将以上中药加10倍量的清水浸泡1h,然后煎煮，水沸后以小火煎40min，过滤；第二次加8倍量的清水煎熬，水沸后小火煎40min，过滤，合并滤液，常压浓缩至69mL(即每1 mL药液含1g原药)，冷却后密封，4℃保存备用。实验药物浓度为22g/(kg·d)。阳性药物为注射用环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX，批号13111325)0.2g/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司提供。CTX药物浓度为50mg/(kg·d),隔日1次。

1.3试剂及仪器抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒(Dako Denmark A/S，批号20140425)；NF-KBp65一抗(proteintech，批号00017138)；MMP9一抗(proteintech，批号00020746)；二抗HRP标记山羊抗兔(谷歌生物，批号20140415)；BSA(Roche，批号3200687)；倒置显微镜(LEICA,DMI3000B)；切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)；烘箱(上海福玛实验设备有限公司，DGX-9003B)；脱色摇床(北京六一仪器厂，WD-9405A)；普通光学显微镜(重庆光电仪器有限公司，XSP-C204)。

1.4动物处理

1.4.1肝癌H22细胞接种方法小鼠肝癌H22细胞的培养及传代:将腹水型小鼠肝癌H22细胞,于37℃、5%CO2培养箱,用含10% FCS的RPMI 1640完全培养基悬浮培养。取最佳生长状态的小鼠肝癌H22细胞,浓度调为5×106个/mL,以0.2 mL/只(1×106个细胞/只)无菌注入小鼠腹腔进行接种传代,于接种7～9d,小鼠腹部膨隆,出现腹水,可用于小鼠皮下移植瘤的接种。

1.4.2动物模型制作荷H22肝癌小鼠模型的建立[4]：将接种H22瘤种7～9d，腹部隆起明显的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，以无菌生理盐水稀释后,1500 r/min离心5 min,调整瘤细胞浓度为5×106个/mL,于小鼠右腋下行皮下无菌接种,接种量为每只0.2 mL/只。

1.4.3动物分组造模结束后，小鼠随机分为模型组、化疗组、六味组、六味化疗组，每组10只。

1.4.4给药模型组：接种24h后，以0.2mL生理盐水灌胃，q12h；化疗组：接种24h后，CTX以50mg/(kg·d)剂量隔日腹腔注射；六味组：造模前两周即开始按22g/(kg·d)灌胃给药，q12h；六味化疗组：接种24h后，六味按22g/(kg·d)灌胃给药，q12h，CTX以50mg/(kg·d)剂量隔日腹腔注射。2W后，处死各组小鼠。

1.5抑瘤率与脾指数的计算称鼠重、瘤组织及脾脏重量，计算抑瘤率和脾指数，公式如下：抑瘤率=(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%，脾指数=脾脏重量/体重。

1.6免疫组织化学法肿瘤组织检测MMP9、NF-kB蛋白的表达水平方法如下：组织切片、脱蜡、水化、洗涤、抗原修复、洗涤、灭活酶、洗涤、5%BSA封闭、一抗分别为MMP9(1∶100)、NF-kB(1∶100)，4℃过夜孵育14h；第2日室温复温3h后，PBS漂洗3×5min；加入二抗，4℃孵育50 min；漂洗，DAB显色；漂洗，苏木素复染，贴片，脱水和透明，中性树胶封片。以LEICA倒置显微镜拍照，每张标本按顺序选5个视野，Image-Pro Plus 6.0分析，用平均光密度(D)表示阳性物质的相对含量。

2结果

2.1六味地黄汤联合CTX对荷H22肝癌小鼠瘤重及脾指数的影响结果见表1。

表1　六味地黄汤联合CTX

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与化疗组比较,#P<0.05,##P<0.01;与六味组比较▲P<0.05。实验过程中，化疗组及六味化疗联合组均有1只小鼠死亡。

结果表明：与模型组比较化疗组及六味化疗联合组具有明显的抑瘤作用(P<0.01)，六味组虽有一定的抑瘤效果但与模型组比较差异无统计学意义，且六味化疗联合组的抑瘤作用优于六味组(P<0.05)；六味组脾指数增大，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，六味组、六味化疗联合组的脾指数均高于化疗组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

2.2六味地黄汤联合CTX对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-KB蛋白表达的影响结果见表2。

结果显示：六味化疗联合组能减少MMP9蛋白的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；化疗组、六味组、六味化疗组均能降低NF-KB蛋白的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2六味地黄汤联合CTX

组别nMMP9光密度NF-KB光密度模型组100.050±0.0230.145±0.065化疗组90.039±0.0160.092±0.037**六味组100.043±0.0160.110±0.028*六味化疗组90.034±0.012*0.092±0.016**

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01；实验过程中，化疗组及六味化疗联合组均有1只小鼠死亡。

3讨论

在人体的免疫系统中，NF-KB被认为是免疫系统最重要的转录因子，近年来的研究表明其异常激活也是导致肿瘤发生发展的关键诱因之一[5]，能通过对相应基因的转录调节，促进肿瘤的发生、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[6]，亦可促使肿瘤产生放化疗抵抗而影响治疗效果。

而MMP9则被认为是肿瘤侵袭和转移的一个重要分子标记，大量的实验研究表明，其在癌细胞的快速增殖、侵袭及转移的过程中起到很重要的作用[7-8]。其可通过降解ECM的分子物质[9]、调节细胞的黏附性[10]、配合其他酶类降解血管基底膜和血管周围基质[11]等方式促进肿瘤浸润及转移，因此抑制其表达可能会有效地抑制肿瘤的侵袭和转移。

基于六味地黄汤在临床上已广泛用于化疗的辅助治疗[12-13]以及赵益[14]将六味地黄汤用于BEL-7402肝癌细胞培养证实其体外有抑制肝癌细胞增殖的研究基础上，我们将该方用于荷H22肝癌模型小鼠，探索六味地黄汤辅助化疗药物对肝癌细胞增殖及免疫功能的影响，并探讨其辅助化疗的协同机制。

本研究结果显示，化疗组及六味化疗联合组具有明显的抑瘤作用，虽然两药联用在抑瘤方面与化疗药单独使用无明显差别，但却可以显著提高肝癌动物的脾指数，增强其免疫功能。六味辅助化疗治疗肝癌，虽然对NF-kB蛋白表达无明显影响，却能显著降低MMP9蛋白表达水平，有较好的协同作用，这将有可能减少肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。

由此可见，六味地黄汤辅助环磷酰胺可提高肝癌动物的免疫功能，其抗肝癌的协同机制可能不是通过NF-KB，而是通过降低肝癌组织MMP9蛋白表达来实现。该研究结果可为六味地黄汤辅助化疗药物治疗肝癌的临床应用提供理论支撑。

参考文献

[1]饶斌,谢斌,余功,等.滋阴方六味地黄丸抗肿瘤研究进展[J].江西中医药大学学报,2014,26(1):84-87.

[2]杜标炎,周瑶,易华,等.六味地黄丸入血成分对自杀基因杀伤肝癌细胞的增效作用[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(16):220-224.

[3]王文海,周荣耀,吴丽英,等.六味地黄合四君子汤对原发性肝癌介入术后患者细胞免疫功能的调节作用[J].辽宁中医杂志,2006,33(10):1 225-1 227.

[4]刘海军,孙晋民,贾兰玲.杜香提取物抑制荷瘤H22小鼠生长的实验研究[J].中国老年学杂志,2011,31(19):3 743-3 744.

[5]Karin M. Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression[J].Nature,2006,441(7092):431-436.

[6]de Winther MP,Kanters E,Kraal G,et al.Nuclear factor kappaB signaling in atherogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(5):904-914.

2012,29(13):115-123.

[8]Li G,Zhang Y,Qian Y,et al.Interleukin-17A promotes rheumatoid arthritis synoviocytes migration and invasion under hypoxia by increasing MMP2 and MMP9 expression through NF-kB/HIF-1α pathway[J].Mol Immunol,2013,53(3):227-236.

[9]Tummalapalli P,Spomar D,Gondi CS,et al.RNAi-mediatedabrogation of cathep sin B and MMP -9 gene expression in a malignant meningioma cell line leads to decreased tumor growth,invasion and angiogenesis[J].Int J Oncol,2007,31(5):1 039-1 050.

[10]Yamada K.Endogenous modulators for drug dependence[J].Biol Pharm Bull,2008,31(9):1 635-1 638.

[11]Xu TM,Cui MH,Xin Y,et al.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 on ovarian cancer metastasis[J].Chin Med J(Engl),2008,121(15):1 394-1 397.

[12]高芳,王大庆,王红梅.六味地黄丸在肿瘤化疗中的应用[J].中国中医急症,2010,16(2):210-211.

[13]杨义明,杜钢军,林海红，等.六味地黄汤及其拆方对阿霉素治疗小鼠试验性肝癌的影响[J].河南大学学报(医学版),2009,28(2):129-132.

[14]赵益,罗蓉,朱卫丰,等.六味地黄丸对肿瘤细胞抑制作用的研究[J].中药新药与临床药理,2011,22(6):598-602.

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Effect of Liuwei Dihuang Decoction with Adjuvant Cyclophosphamide on MMP9, NF-kB Expression in H22 Tumor-bearing Mice

RAO Bin, XIE Bin, XIE Xiong, YU Gong, LIU Hong-ning

JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China

Abstract:Objective: To observe the effect of Liuwei Dihuang decoction(LW) with adjuvant cyclophosphamide(CTX) on MMP9, NF-kB expression in H22 tumor-bearing mice. Methods: 40 male Kunming mice were divided into model group, CTX group, LW group and the group using the LW and CTX,each group contained 10 mice. Animal models of H22 tumor- bearing mice was induced with the axillary injection of H22 cells, LW group started medication at molding two weeks before(22g/kg·d), CTX group(50mg/kg·2d) and the combination group started medication after molding. After 14d modeling, kill the mice and weigh, weighing the tumor tissue and splenic tissue, calculation of the antitumor effect and spleen index, testing the expression of MMP9,NF-kB protein on immunohistochemistry assay. Results: The CTX group and the combination group have obvious antitumor effects (P<0.01), and the combination group had better effect on antitumor than LW group (P<0.05). LW group Spleen index increased, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05), LW group and the combination group spleen index all higher than CTX group (P<0.05 or P<0.01).Compared to the model group,the combination group have declined significantly on the expression of MMP9 (P<0.05); LW group, CTX group and the combination group all have declined significantly on the expression of NF-kB (P<0.05 or P<0.01). Conclusion: In this scheme of combination with chemotherapy for hepatocellular carcinoma , can improve the immune function ,the auxiliary mechanism of LW may not by NF-KB, but by reduced the expression of MMP9 protein in hepatocellular carcinoma tissue to achieve.

Key words:Liuwei Dihuang Decoction; Cyclophosphamide; Liver Cancer; MMP9; NF-KB

收稿日期：(2014-12-02)编辑：曾文雪

中图分类号：R285.5

文献标识码：A