急性髓细胞白血病WHO分型及临床意义

急性髓细胞白血病WHO分型及临床意义

杜秀敏，陈英剑，孙子涵，胡成进*

(济南军区总医院 实验诊断科，山东 济南250031)

传统的FAB分型受检验者细胞层面认知局限性的限制，诊断准确率低，已远远不能满足临床的需求。因而在一些规模较大的实验室，FAB分型已逐渐被WHO分型所取代。本研究对126例急性髓细胞白血病的WHO分型特征进行总结，并与FAB分型相比较，探讨其细胞形态与免疫表型特征的关系，以助于提高我们对急性髓细胞白血病的实验室诊断水平。

1资料和方法

1.1　一般资料

收集2007年9月-2013年9月共126例急性髓细胞白血病标本。男性72例，女性54例，年龄1岁-81岁，中位年龄37岁。所有患者均行骨髓细胞形态学、流式细胞术检测。74例(50.8%)患者行染色体核型分析，32例(25.4%)患者行融合基因AML1-ETO及PML-RARα检测。

1.2　仪器与试剂

瑞氏染色液为本实验室自制。细胞过氧化物酶染色(POX)，糖元染色(PAS)及醋酸萘酚酯酶染色(NAE)试剂盒均系上海太阳生物技术公司产品。白血病免疫分型主要采用的抗体有髓系细胞系(CD13、CD33、CD14、CD15、cMPO)，B细胞系(CD10、CD19、CD20)，T细胞系(CD5、CD7)，干/祖细胞(CD34、CD38、HLA-DR)。单克隆抗体均系BD公司产品。流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur。

1.3　方法

1.3.1细胞形态学诊断按常规方法进行骨髓穿刺与涂片，一部分涂片行瑞氏染色，另一部分涂片行过氧化物酶染色(POX)、糖元染色(PAS)及醋酸萘酚酯酶染色(NAE)。油镜下分类计数200个细胞，按FAB分型法对其进行急性白血病分型。

1.3.2细胞免疫分型取EDTA抗凝的患者骨髓或静脉血1-2 ml备用。取100 μl(细胞数>106个)，分别加入相应的单克隆抗体20 μl，混匀后室温避光放置15 min，加2 ml溶血素反应8 min，离心洗涤弃上清，悬浮细胞，上流式细胞仪检测。检测前用标准荧光微球校正荧光补偿，CD45/SSC 双参数散点图设门，每管获取10 000个细胞应用CELL-QUEST 软件进行数据处理与分析。阳性判断标准：以≥20%为阳性。免疫分型结果判读参考我国诊断标准及欧美国家提倡的抗原积分标准[1]。

1.3.3染色体核型分析采集2 ml骨髓标本，用肝素抗凝，分离单个核细胞，培养24 h后，常规制备染色体标本，G显带技术显带，镜下分析20个分裂相。按《国际人类细胞遗传学国际命名法(ISCN) 2005》[2]进行核型分析。

1.3.4融合基因检测取患者EDTA抗凝骨髓2 ml，用RT-PCR法或FISH法检测AML1/ETO和PML-RARα融合基因，具体方法见文献[3]。

2结果

2.1　细胞形态学分型

126例急性髓细胞白血病中，按FAB 分型标准M0 4 例，M1 8例，M2 18例，M3 14例，M4 22例，M5 37例，M6 6例，M7 1例，AML 10例，FAB不能分型6例。

2.2　细胞免疫分型

AML患者髓系抗原表达情况：按表达率高低依次为CD33(86.5%)、cMPO (85.7%)、 CD13(69.8%)、CD117(52.6%)、CD15(57.9%)、CD14(19.8%)；淋系抗原表达情况：本组资料中21.4%AML患者伴有淋系抗原表达，主要为：CD7 (10.3%)、CD19(6%)、CD10 (4.8%)、CD5(3.9%)；非系列特异性抗原表达情况：CD34(57.9%)、CD38(38.9%)、HLA-DR(44.4%)；M3患者中缺乏CD34、HLA-DR表达，CD14在M4或M5中的表达率明显高于其他亚型。

2.3　染色体核型分析

74例AML患者中26例染色体核型正常，占35.1%；异常核型48例，异常核型检出率64.9%，其中AML伴重现性遗传学异常31例，占41.9%，包括t(8;21)易位14例(18.9%)、t(15;17)易位10例(13.5%)、inv(16)倒位4例(6.3%)和11q23异常3例，其他异常核型17例(22.9%)。t(8;21)易位主要见于M2，inv(16)主要见于M4，而t(15;17)易位仅见于M3亚型。

2.4　融合基因检测

32例AML患者分别行AML1-ETO及PML-RARα融合基因分析：AML1-ETO共检测19例(M2 15例，M4 3例，M3 1例)，阳性10例见于M2患者，另2例见于M4，占M2的66.7%；PML-RARα共检测14例(M3 10例，M5 2例，M2 2例)，阳性9例均见于M3患者，占M3的90%。

2.5　FAB分型与WHO分型的比较

FAB分型中有5例与WHO分型不符：2例M3和1例M1为AML伴t(8;21)(q22;q22) (AML1/ETO)(FAB M2)；1例M0为AML伴t(15;17)( q22;q12)(PML/RARα)(FAB M3)；1例M2为双表型急性白血病(BAL)。FAB不能分型的6例急性白血病，后经免疫分型、染色体核型分析及融合基因检测证实：2例为M0，1例为proB-ALL，1例为M1，2例为BAL(髓系和T细胞标志共表达)，FAB诊断符合率91.3%(115/126),见表1。

表1　患者FAB分型与WHO分型的比较

3讨论

骨髓细胞形态学和细胞化学染色技术是诊断急性白血病的基础，但对于微分化型及一些形态学不典型的急性白血病，其诊断具有一定的局限性。随着流式细胞免疫分型技术、细胞遗传学和分子生物学技术的不断发展，以MICM分型技术为基础的WHO诊断标准在国内外逐渐普及完善，提高了急性白血病诊断的准确性及客观性。在“WHO造血组织和淋巴组织肿瘤分类方案(2001)”中对AML所作的主要修改有：1)将诊断AML的原始细胞下限降低为20%；2)将伴有重现性细胞遗传学异常、有多系发育异常以及此前有放、化疗病史或有先期MDS的AML独立单列；3)强调有重现性细胞遗传学异常者，虽原始细胞<20%也应诊断为AML，而不诊断为MDS；4)将M6细分为M6a和M6b。

在WHO分类方案中，免疫分型仍然起着决定性的作用。研究发现，POX<3%的AML细胞形态学诊断与免疫细胞化学结果的诊断吻合率仅为53.3%，此类白血病在细胞形态学上表现复杂，必须依赖于免疫分型才能确诊[4]。本组126例急性髓白血病患者免疫学分型与形态学分型比较发现，免疫分型对M3和急性单核细胞白血病的的确诊起着关键作用。CD14是单核细胞较特异的表面标志，其在M4或M5中表达较高，故有助于M4或M5与其它亚型的鉴别诊断；CD34和HLA-DR是干祖细胞标志，极少在M3患者表达。而进一步的细胞遗传学分析和融合基因检测则对M3和M2分型的鉴别诊断起着至关重要的作用。

本组病例中，AML1-ETO融合基因阳性多见于M2患者，而PML-RARα阳性仅见于M3患者，且均与特征性的染色体核型异常有较高的一致性：具t(8;21)易位的AML常见于M2，易位产生了AML1/ETO融合蛋白，导致粒系和粒单细胞系发育的关键调控子C/EBP-α和PU.1的失调[5]；而t(15;17) 易位则是M3的典型遗传学特征，它导致位于17q12的RARα基因与PML编码序列相连，产生PML-RARα融合蛋白，这类易位在APL中占99%[6]，说明此类融合基因及其特征性的染色体核型在其临床诊断中的重要性。近年来，越来越多的研究证明染色体核型可以作为AML的独立预后因素，它在一定程度上决定着急性白血病患者的诊疗及预后。研究发现，约52%的AML具有染色体异常，可分为两种类型：一种是具有平衡易位的AML，如 t(8;21)，t(15;17)和inv16；另一种是不平衡易位如5q-,7q-,-5,-7和复杂核型的AML。在平衡易位中，常见的染色体特殊亚型为急性早幼粒(APL)中的t(15;17) 易位或伴有成熟的急性髓细胞白血病(AML-M2)中的t(8;21)易位，它们与良好的预后相关[7]。在染色体不平衡易位中染色体的全部或部分丢失占优势，尤其是5、7和17号染色体，经常增多的是8号染色体[8]。具有不平衡易位的AML预后较差，仅有10%-15% 的长期生存者[9]。因而染色体易位、易位导致的相关基因的鉴定及异常融合蛋白的识别揭示了不同AML亚型间的生物学意义，有助于患者的个体化诊疗。

本组病例中检出AML伴多系发育异常9例，包括此前有MDS 病史7例及无MDS 2例，此类患者多为伴有复杂核型的AML，预后不良，难治易复发。其骨髓涂片中易见多系发育异常，常可见淋巴样小巨核细胞。因而对于此类病人及早进行染色体核型分析，对于治疗方案的选择极为重要。与WHO分型相比较，本组病例的形态学诊断符合率仅为91.3%(115/126)，其形态学易误诊的为M2，在这几例M2患者的骨髓涂片中均出现较高比例的早幼粒细胞，且原始粒细胞胞浆多颗粒(Ⅲ型原粒多见)，因而易误诊为M3。但进一步的检测发现，特征性的染色体异常t(8;21)易位及融合基因AML1/ETO阳性、PML-RARα阴性使其与M3相区别。故有学者提出在早幼粒细胞比例较高时，若原粒细胞大于10%，诊断M3应慎重[10]，此时应进行免疫分型、细胞遗传学分析及融合基因检测以确诊。形态学不能分型的6例急性白血病，后经免疫分型、染色体核型分析及融合基因检测证实：2例为M0，1例为M1，2例为双表型急性白血病(髓系和T细胞标志共表达)，1例为混合细胞型白血病(单核细胞和T细胞)。由此可见，免疫分型对微分化型、双表型或混合型急性白血病的诊断有着不可替代的优势。

目前，随着对急性白血病研究的深入和分子诊断水平的提高，越来越多的髓系抗原阳性的ALL(My+ALL)、淋系抗原阳性的AML(Ly+AML)、双系列或双表型急性白血病被发现，此类白血病的临床表现及预后均与单纯的淋系或粒系不同，因而免疫分型对急性白血病的个性化诊疗起着重要作用。尤其是随着对急性髓细胞白血病发生发展过程中细胞遗传学及分子生物学机制研究的深入，针对AML特异性靶向药物在临床的开展应用，传统的FAB分型已远不能满足临床的需求，以细胞形态为基础，免疫分型、细胞遗传学分析及分子生物学基因检测等多手段联合的WHO分类方案的发展与应用，必将推动白血病临床个性化诊断与治疗的进展，使其实验室诊断更为准确可靠，并为其靶向基因治疗提供分子依据。

参考文献：

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[10]丛玉隆,李顺义,卢兴国.中国血细胞诊断学[M].第1版.北京：人民军医出版社,2010.

收稿日期：(2013-12-26)

文章编号：1007-4287(2015)01-0136-03

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