实时荧光定量聚合酶链反应技术对结核性脑膜炎的诊断价值

杨　柳，苏明权，马越云，辛毅娟，韩若冰，张　荣，文　静，郝晓柯

(第四军医大学西京医院 全军医学检验中心，陕西 西安710032)

实时荧光定量聚合酶链反应技术对结核性脑膜炎的诊断价值

杨柳，苏明权，马越云，辛毅娟，韩若冰，张荣，文静，郝晓柯*

(第四军医大学西京医院 全军医学检验中心，陕西 西安710032)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0035)

结核性脑膜炎是结核病中最常见的病种，主要是由于结核分枝杆菌侵入到蛛网膜下隙，继而引起软脑膜、蛛网膜并累及脑神经和脑实质等的非化脓性炎症[1]。目前对结核性脑膜炎的诊断主要根据病史、症状及体征、脑脊液的实验室检查等综合评估而作出诊断。但研究显示,结核性脑膜炎的临床表现和实验室检查并不典型，因而对结核性脑膜炎的诊断常出现漏诊和误诊，进而延误对患者病情的救治[2]。因此，快速、有效地检测结核分枝杆菌并作出临床诊断是有效改善患者病情的重要手段[3]。本研究采用涂片、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)技术对神经系统类疾病的脑脊液标本进行结核性分枝杆菌检测，并对检测结果进行比较分析，以期为指导临床诊断结核性脑膜炎提供参考。

1资料与方法

1.1　一般资料

选取2010年5月—2013年5月我院神经内科门诊和感染科门诊收治的57例结核性脑膜炎患者、105例疑似结核性脑膜炎患者和120例非结核性脑膜炎患者为研究对象。其中结核性脑膜炎67例，男37例，女30例，年龄18-71岁，平均(35.7±12.6)岁；疑似结核性脑膜炎105例，男63例，女42例，年龄21-70岁，平均(36.2±13.1)岁，其中癫痫11例，脑炎35例，脑积水13例，脑梗死15例，嗜睡6例，颅内感染10例，脊髓病变8例，其他如抽搐、四肢无力等5例；非结核性脑膜炎120例，男69例，女51例，年龄19-72岁，平均(36.8±11.5)岁，其中病毒性脑膜炎56例，新型隐球菌脑膜炎19例，化脓性脑膜炎45例。

结核性脑膜炎的诊断标准[4]：①在急性或者亚急性脑膜炎基础上，经脑脊液检查有结核菌存在，或者皮肤结核菌素试验显示为阳性；②患者血、脑脊液经细胞学检查均为阴性；③存活病例经抗结核治疗后好转或痊愈。

1.2　方法

1.2.1涂片法对入院后的患者行腰椎穿刺，并抽取部分脑脊液标本留待后用。取脑脊液标本1 ml，在3 000 r/min的转速下离心15 min，保留离心后的沉渣进行涂片和固定，并进行抗酸染色，最后在显微镜视野下观察结核杆菌。整个过程严格按照《结核病细菌学检验规程》进行。抗酸染色剂由珠海贝索生物技术有限公司提供。

1.2.2RT-PCR法将抽取的非血性脑脊液标本中的1 ml置于1.5 ml的无菌离心管中，在1 4000 r/min转速下离心10 min，然后将1 ml无菌生理盐水加入到离心弃去上清液的沉淀中，同时振荡使之均匀悬浮，将沉淀留待后用。将抽取的血性脑脊液1 ml置于1.5 ml的无菌离心管中，在14 000 r/min转速下离心10 min，然后将1 ml无菌去离子水加入到弃去上清液的沉淀中，并反复洗涤溶液使红细胞被洗掉，最后留下沉淀以备后用。分别在两种沉淀中加入50 μl DNA提取液，并将其振荡以混合均匀，然后将其置于100℃的金属浴中，10 min后，在14 000 r/min转速下离心10 min，取离心后的上清液2 μl并将其置于到聚合酶链反应的试管内。最后进行循环反应，步骤为：在92℃条件下进行预变性，2 min后按照93℃的环境45 s，然后在55℃的环境50 s进行10个循环，循环完成后，再按照93℃的环境30 s，55℃的环境45 s进行30个循环。结果的判断标准：循环阈值(cycle threshold,Ct)<30且曲线是标准的S形，结果计为阳性；如果Ct没有出现数值，则结果计为阴性。其中RT-PCR的检测试剂为结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司提供)，检测仪器为美国ABI-7500实时荧光定量PCR仪。

1.3　统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行数据录入和统计分析，计数资料描述采用率(%)，比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1　三组患者脑脊液涂片和RT-PCR法检测结果比较

涂片法检测发现10例阳性，其中结核性脑膜炎7例(70.00%)，疑似结核性脑膜炎3例(30.00%)；RT-PCR法检测发现46例阳性，其中结核性脑膜炎31例(67.39%)，疑似结核性脑膜炎15例(32.61%)。在结核性脑膜炎患者的检测中，涂片法阳性率为12.28%，RT-PCR法阳性率为54.39%，涂片法阳性率低于RT-PCR法，差异有统计学意义(P<0.05)；在疑似结核性脑膜炎患者的检测中，涂片法阳性率为2.91%，RT-PCR法阳性率为14.56%，涂片法检测的阳性率低于RT-PCR法的阳性率，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　三组患者脑脊液涂片法和RT-PCR法检测结果比较　例

2.2　两种检测方法的诊断价值

脑脊液涂片法检测结核性脑膜炎的灵敏度为12.28%，漏诊率为87.72%，特异度为100%；RT-PCR法检测的灵敏度为54.39%，漏诊率为45.61%，特异度为100%，RT-PCR法的灵敏度高于涂片法，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2　两种方法在结核性脑膜炎患者中的诊断价值

注：※与涂片法比较，P<0.05。

3讨论

结核性脑膜炎是临床常见的严重的肺外结核病，具有病死率高和致残率高等特点，严重地威胁着患者的健康和生命质量。结核性脑膜炎由于不典型的临床表现和实验室检查，常常延误对病情的诊治而导致患者的预后较差，因而，早期准确的诊断和及时有效的治疗是改善患者病情和提高临床预后最有效的手段[5]。目前，临床上对结核性脑膜炎最有效的诊断方法是在脑脊液中检出结核分枝杆菌，传统的诊断结核性脑膜炎的方法是涂片法，即对结核杆菌进行培养并对标本涂片检测。涂片法因为具有简便、快速等特点而广受临床医生的关注，但有报道显示涂片法的灵敏度低，特异度差，同时也不能将死菌和活菌区分开来[6]。随着医学技术的不断发展，RT-PCR法因为方法学方面的优越性而逐渐用于基因表达、病原体检测等研究领域[7]。该方法具有以下优点：①在常规的PCR法基础上，RT-PCR法加入了荧光探针，从而将核酸扩增、杂交以及光谱技术巧妙地融合在一起；②RT-PCR法不需要将管盖打开，因而对实验室造成PCR产物的污染；③RT-PCR法的整个过程和结果均由计算机操作，因此简单快速；④灵敏度高、重现性好，同时还能根据每个样本Ct值而获得标准的S形曲线；⑤通过实时监测RT-PCR法的整个过程，解决了传统方法中只能对终点进行定量检测的缺陷。

查阅国内相关文献发现，关于涂片法和RT-PCR法检测结核性脑膜炎的诊断价值比较的文献还很少。本研究采用两种方法分别对结核性脑膜炎、疑似结核性脑膜炎和非结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行检测，结果发现，在结核性脑膜炎患者的检测中，涂片法阳性率为12.28%，RT-PCR法的阳性率为67.39%，与唐神结等人[8]的研究结果相似，并且涂片法阳性率低于RT-PCR法，差异有统计学意义。而在疑似结核性脑膜炎患者的检测中，涂片法阳性率为2.91%，RT-PCR法阳性率为14.56%，差异有统计学意义。提示我们RT-PCR法作为检测结核性脑膜炎的方法诊断价值较高。结果还显示，脑脊液涂片法检测结核性脑膜炎的灵敏度为12.28%，漏诊率为87.72%，说明传统方法检测结核性脑膜炎的灵敏度较低，与有关研究结果一致[9]。RT-PCR法检测的灵敏度为54.39%，高于涂片法的灵敏度，差异有统计学意义，与有关研究结果一致[10]，提示我们RT-PCR法检测结核性脑膜炎的灵敏度高。因此，如果患者出现结核性脑膜炎的明显临床症状和体征时，建议早期且持续地进行脑脊液结核分枝杆菌检测具有重要的临床价值。但是本研究中RT-PCR法的阳性率低于其他研究报道[11]，可能原因是：①患者进行了抗结核治疗，导致在检测过程中出现了低阳性率；②由于对脑脊液标本中的结核分枝杆菌DNA的拷贝数量较低，继而没有达到试剂检测的下限，因此，检测结果可能显示为阴性；③在脑脊液标本采集过程中，有部分沉渣可能存在剥脱现象，因而可能引起结果检出率的下降。

参考文献：

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[2]杨笑,吴若芬,孔繁元,等.结核性脑膜炎临床及脑脊液细胞学分析[J].中国现代神经疾病杂志,2012,12(2):198.

[3]陈卓,李晓民,刘艳,等.脑脊液细胞学对结核性脑膜炎的诊断价值[J].中华全科医学,2013,11(4):578.

[4]Gupta BK,Bharat V,Bandyopadhyay D,et al.Role of cerebrospinal fluid adenosine deaminase level estimation in diagnosis of tuberculous meningitis[J].J Indian Med Assoc,2013,111(9): 603,608.

[5]杨学谨.结核性脑膜炎的临床诊治[J].临床医学,2014,34(5):47.

[6]闫世明,秦桂香,赵云虹,等.结核性脑膜炎脑脊液细胞学的临床研究[J].中国防痨杂志,2011,33(12):780.

[7]崔帷,杜可周,关玲,等.实时荧光定量PCR技术在结核性脑膜炎早期诊断中的应用[J].中国实用神经疾病杂志,2013,16(23):104.

[8]唐神结,高文.临床结核病学[M].北京:人民卫生出版社,2011:402-417.

[9]Pasco PM.Diagnosis features of tuberculous meningitis:a cross-sectional study[J].BMC Res Notes,2012,5:49.

[10]吴睿彦,陈志成,肖芃,等.结核分枝杆菌荧光定量聚合酶链反应对结核性脑膜炎的早期诊断价值[J].实用医学杂志,2012,28(17):2867.

[11]冯恩航,王冬梅,杨文碧,等.荧光定量PCR方法检测脑脊液中结核菌DNA的临床意义[J].黑龙江医学,2011,35(4):282.

摘要：目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)对结核性脑膜炎的诊断价值。方法分别采用涂片法、RT-PCR法对结核性脑膜炎、疑似结核性脑膜炎以及非结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行检测，并对检测结果进行比较分析。结果涂片法共检出10例阳性，其中结核性脑膜炎7例(70.00%)，疑似结核性脑膜炎3例(30.00%)；RT-PCR法共检出46例阳性，其中结核性脑膜炎31例(67.39%)，疑似结核性脑膜炎15例(32.61%)。对结核性脑膜炎患者检测，涂片法阳性率(12.28%)低于RT-PCR法阳性率(54.39%)，差异有统计学意义(P<0.05)；对疑似结核性脑膜炎患者检测，涂片法阳性率(2.91%)低于RT-PCR法阳性率(14.56%)，差异有统计学意义(P<0.05)；脑脊液涂片法检测结核性脑膜炎的灵敏度为12.28%，漏诊率为87.72%，RT-PCR法检测的灵敏度为54.39%，漏诊率为45.61%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论RT-PCR法诊断结核性脑膜炎具有灵敏度好，准确度高等特点，临床有重要的指导意义。

关键词：结核性脑膜炎；脑脊液；实时荧光定量聚合酶链反应技术；诊断价值

The diagnosis value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction in tuberculous meningitisYANGLiu，SUMing-quan，MAYue-yun，etal.(InspectionArmyMedicalCenter,XijingHospitalofTheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian,Shanxi,710032)

Abstract:ObjectiveTo investigate the diagnosis value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(TR-PCR) in tuberculous meningitis.MethodsThe cerebrospinal fluid specimens of patients with tuberculous meningitis,suspected tuberculous meningitis and non-tuberculous meningitis were detected by using smear method and RT-PCR respectively,and the testing?results were compared and analyzed.ResultsThere were 10 cases of positive by smear method,including 7 cases of tuberculous meningitis(70.00%) and 3 cases of suspected tuberculous meningitis(30.00%);while 46 cases of positive by TR-PCR method,including 31 cases of tuberculous meningitis(67.39%) and 15 cases of suspected tuberculous meningitis(32.61%).In detection of patients with tuberculous meningitis,the positive rate by smear method was 12.28%,which was lower than 54.39% by RT-PCR method,the difference was statistically significance(P<0.05).In detection of patients with suspected tuberculous meningitis,the positive rate in smear method was 2.91%,which was lower than 14.56% in RT-PCR method,the difference was statistically significance(P<0.05).The sensitivity of smear method in detecting tuberculous meningitis was 12.28%,and the rate of missed diagnosis was 87.72%,while the RT-PCR was 54.39% and 45.61% respectively,the sensitivity of TR-PCR was higher than that of smear method,the difference was statistically significance(P<0.05).ConclusionRT-PCR in diagnosis of tuberculous meningitis has a characteristic of good sensitivity,high accuracy,and it has an important clinical significance.

Key words:Tuberculous meningitis;cerebrospinal fluid;real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction;Diagnosis value

收稿日期：(2013-12-24)

作者简介：杨柳(1978-)，女，硕士，主治医师、讲师，从事分子生物学诊断方面的研究；郝晓柯(1959-)，男，博士，主任医师、教授，从事检验诊断学方面的研究。

文献标识码：A

中图分类号：R529.3

文章编号：1007-4287(2015)01-0035-04

通讯作者*