粘质沙雷菌整合子检测及其与耐药表型的相关性分析

苏维奇，朱元祺,李　莉，毕春霞，闫志勇，邓乃梅

(1.青岛市市立医院 a.检验科；b.医院感染管理科，山东 青岛266011；

2.青岛大学附属医院 检验科；3.青岛大学医学院 微生物教研室)

粘质沙雷菌整合子检测及其与耐药表型的相关性分析

苏维奇1a，朱元祺2,李莉1a，毕春霞1a，闫志勇3，邓乃梅1b*

(1.青岛市市立医院 a.检验科；b.医院感染管理科，山东 青岛266011；

2.青岛大学附属医院 检验科；3.青岛大学医学院 微生物教研室)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0014)

粘质沙雷菌是一种重要的条件致病菌，广泛存在于医院的环境中，在机体抵抗力低下时，可引起呼吸道感染、伤口感染、泌尿道感染以及败血症等多种疾病，并可引起医院内感染的爆发流行[1]。近年来，粘质沙雷菌的检出率逐年增高，并且其耐药现象也日趋严重，该菌的耐药机制复杂多样，包括产生抗菌药物灭活酶、药物作用的靶位改变以及外膜通透性障碍等，其耐药基因可借助质粒、转座子、整合子等多种耐药基因移动遗传因子，在菌种间传播和传递。为了解本地区粘质沙雷菌临床分离株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子的携带情况及其与耐药表型的相关性，我们对临床分离的287株粘质沙雷菌进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子检测，探讨整合子与耐药表型的相关性。

1材料与方法

1.1菌株来源实验菌株来源于青岛大学附属医院和青岛市市立医院的临床分离株，共计287株，所有菌株均经VITEK-2 Compact细菌分析系统进行鉴定，所用菌株鉴定板型为GNI卡，药敏板型为GNS卡，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.2细菌DNA提取采用煮沸法，取细菌培养液2 ml,11 500 g离心1 min，尽量吸净上清，向沉淀物中加入200 μl缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮，向管中加入20 μl蛋白酶K溶液，混匀，加入220 μl缓冲液GB，震荡15 sec，70℃放置10 min，溶液应变清亮，离心以去除管盖内壁的水珠，加入220 μl无水乙醇，充分震荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，离心以去除管盖内壁的水珠，然后移入吸附柱CB3中放到收集管里，13 400 g离心30 s,弃去废液再加入500 μl缓冲液GD，13 400 g离心30 s,弃去废液，加入600 μl漂洗液PW，13 400 g离心30 s,弃去废液，加入50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温放置30 min，将溶液收集至离心管中备用。

1.3PCR引物的设计与合成参照文献[2]设计Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子整合酶编码基因的特异性引物，引物序列及产物大小见表1。

表1　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子基因的特异性引物，引物序列及产物大小

1.4PCR反应及条件优化按照配制的PCR反应混合物，PCR反应体系,RNase Free H2O 17.37 μl,10×PCR Buffer2.5 μl,上游引物(10 μM)1.0 μl,下游引物(10 μM)1.0 μl,TaKaBa Taq(5 U/μl)0.13 μl,模板DNA 1.0 μl,总体积25.0 μl。经反复试验优化，确定PCR反应条件为预变性94℃ 5 min，变性94℃，30 s，退火46℃，30 s，延伸72℃，30 s，共30个循环，延伸72℃ 10 min。

1.5扩增产物的检测取5 μl PCR产物，在含0.5 μg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察电泳结果。

1.6药敏试验采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定和药敏分析仪配套的革兰阴性杆菌药敏卡GNS进行药敏试验，抗菌药物包括氨苄西林、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟、、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和哌拉西林，头孢哌酮/舒巴坦采用K-B法，药敏结果按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2011年标准进行判读。

1.7统计学分析应用SPSS13.0软件分析Ⅰ类整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药差异，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1整合子检测结果在287株粘质沙雷菌中，有262株细菌检出Ⅰ类整合子，检出率为91.3%，3株细菌检出Ⅲ类整合子，未检出Ⅱ类整合子。部分粘质沙雷菌Ⅰ类整合子PCR扩增电泳结果见图1。

M：100 bp ladder marker(100,200,300,400,500,600,700,800,900,1 000 bp)；1-13：临床标本；N：阴性对照；P：阳性对照

图1粘质沙雷菌Ⅰ类整合子(intI)PCR扩增电泳图

2.2Ⅰ类整合子阳性与阴性菌株药敏结果比较Ⅰ类整合子阳性菌株对环丙沙星和头孢噻肟的耐药率高于Ⅰ类整合子阴性菌株(P均<0.05)，对其他抗菌药物的耐药性，Ⅰ类整合子阳性菌株和阴性菌株间差异无统计学意义(P均>0.05),见表2。

表2　Ⅰ类整合子阳性菌株与阴性菌株的药敏结果

3讨论

整合子是存在于细菌质粒和(或)染色体上的一种遗传结构，它具有捕获、重排和表达耐药基因的能力，是细菌多重耐药迅速发展的重要原因[3]。整合子在整合酶的催化下，能通过位点专一重组系统整合外来的耐药基因，使耐药基因不断的积累，从而使细菌具有耐药性和多重耐药性，并通过整合机制使得耐药基因快速传播和扩散[4]。

整合子在参入细菌耐药性的传播和扩散方面，受整合子整合酶、整合子基因盒以及Ⅰ型整合子样结构和插入序列共同区(ISCR1)等物质的作用和影响。有文献报道，ISCR1的广泛存在可能会造成多种耐药基因的流行和跨种属传播[5]。然而孙静静等在对59株泛耐药鲍曼不动杆菌整合子Ⅰ和ISCR1结构及基因型研究中发现，ISCR1的携带率较低，Ⅰ类整合子的检出率高达86%，而ISCR1的检出率只有5.3%[6]，由此可见，整合子与ISCR1之间的相互关系是否在不同细菌的种属间存在差异还有待进一步研究。

本项目研究结果发现，在287株粘质沙雷菌中，有262株细菌检出Ⅰ类整合子，检出率为91.3%，3株细菌检出Ⅲ类整合子，未检出Ⅱ类整合子，Ⅰ类整合子的检出率高于阴沟肠杆菌(77.9%)和肺炎克雷伯菌(57.91%)等肠杆菌科细菌[7,8]，说明Ⅰ类整合子在粘质沙雷菌中普遍存在。Ⅰ类整合子阳性菌株对环丙沙星和头孢噻肟的耐药率明显高于Ⅰ类整合子阴性菌株，差异有统计学意义，可能与菌株携带qnr基因和blaCTX-M基因有关。Ⅰ类整合子阳性菌株和阴性菌株对青霉素类和大多数头孢类药物的耐药表型差异无统计学意义，其机制有待进一步研究。

综上所述，本研究通过对287株粘质沙雷菌整合子的携带情况与其耐药表型比较分析，结果发现粘质沙雷菌Ⅰ类整合子的携带率较高，并且在粘质沙雷菌中整合子与其耐药表型特别是与多重耐药性无明显的相关性。

参考文献：

[1]Ktari S,Mahjoubi F,Mnif B,et al.Investigation of three nosocomial outbreaks of Serratia marcescens in an intensive care unit in Sfax-Tunisia[J].Tunis Med,2010,88(7):501.

[2]Goldstein C,Lee MD,Sanchez S,et al.Incidence of class 1 and 2 integrases in clinical and commensal bacteria from livestock,companion animals,and exotics[J].Antimicrob Agents Chemother,2001，45:723.

[3]Rech GD,Hall RM.Gene Cassettes A new class of mobile element[J].Microbiology,1995,141(12):3015.

[4]李彦媚，赵喜红，徐泽智，等.新型细菌耐药元件—整合子系[J].中国抗生素杂志，2012,31(1)：1.

[5]陈霞，袁敏，李桂喜，等.基因捕获元件int1和ISCR1在临床菌株中的分布及与细菌耐药性的关系研究[J].中国人畜共患病学报，2013,29(7)：646.

[6]孙静静，吴奎海，陈清，等.泛耐药鲍曼不动杆菌整合子Ⅰ和ISCR1结构及基因分型研究[J].热带医学杂志，2012,12(4)：390.

[7]李岩，苏建荣，徐淑珍，等.阴沟肠杆菌的Ⅰ类整合子检测及相关耐药基因分析[J].中国实验诊断学杂志，2010,14(9)：1356.

[8]毛璞，傅威，邱桂霞，等.肺炎克雷伯菌Ⅰ类整合子的检测与鉴定[J].中国抗生素杂志，2013,38(3)：235.

摘要：目的了解本地区粘质沙雷菌临床分离株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子的携带情况，探讨整合子与其耐药表型的相关性。方法收集临床分离的经VITEK-2 Compact细菌分析系统鉴定的粘质沙雷菌287株，以煮沸法制备细菌DNA作为PCR扩增模板，采用聚合酶链反应(PCR)检测菌株的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子，分析比较整合子阳性菌株与阴性菌株的药敏试验结果差异。结果在287株粘质沙雷菌中，有262株细菌检出Ⅰ类整合子，检出率为91.3%，3株细菌检出Ⅲ类整合子，未检出Ⅱ类整合子。药敏结果显示，第Ⅰ类整合子阳性菌株对环丙沙星和头孢噻肟的耐药率高于Ⅰ类整合子阴性菌株(P均<0.05)，对其他抗菌药物的耐药性，Ⅰ类整合子阳性菌株和阴性菌株间差异无统计学意义(P均>0.05)。结论Ⅰ类整合子在粘质沙雷菌中普遍存在，Ⅰ类整合子与粘质沙雷菌的多重耐药无明显的相关性。

关键词：粘质沙雷菌；耐药性；整合子

Serratia marcescens integron test and Associated analysis with drug resistance phenotypeSUWei-qi,ZHUYuan-qi,LILi,etal.(Departmentoflaboratory,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266011,China)

Abstract:ObjectiveUnderstanding of the carrying situation in the region of Serratia marcescens isolates Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ integron,To explore the relationship between integrons and drug resistance phenotype.MethodsClinical isolates collected by VITEK-2 Compact analysis system for identification of 287 strains of Serratia marcescens.Prepared to boil PCR amplification of bacterial DNA as a template,using the polymerase chain reaction (PCR) testing of classⅠ,Ⅱ,Ⅲ integron.Analysis and comparison the differences of integron positive strains and negative strains in drug sensitive test.ResultsIn 287 strains of Serratia marcescens,262 strains of bacteria detected integron,the detection rate was 91.3%,3 strains of bacteria detected class Ⅲ integron,II integron were not detected.The drug sensitivity results showed,the classⅠ integron positive strains resistant to ciprofloxacin and cefotaxime were higher than that of Ⅰintegron negative strains (P<0.05).Resistance to other antimicrobial drugs,among Ⅰ integron positive and negative strains were no significant differences (P>0.05).ConclusionⅠ integron prevalent in Serratia marcescens,class Ⅰ integron and multidrug-resistant Serratia marcescens is no significant correlation.

Key words:Serratia marcescens;Drug resistance;Integron

收稿日期：(2014-05-10)

文献标识码：A

中图分类号：R446.5

文章编号：1007-4287(2015)01-0014-03

通讯作者*

基金项目：青岛市公共领域科技支撑计划项目[2012-1-3-1-(18)-nsh]