多发性骨髓瘤患者miR-21和miR-32的表达及临床应用

沈继春,李　阳,刘晓梅,张爱民,刘冀琴

(中国人民武装警察部队后勤学院附属医院 1.血液科;2.骨科;3.检验科,天津300162)



多发性骨髓瘤患者miR-21和miR-32的表达及临床应用

沈继春1,李阳2,刘晓梅3,张爱民3,刘冀琴3

(中国人民武装警察部队后勤学院附属医院 1.血液科;2.骨科;3.检验科,天津300162)

摘要：目的探讨microRNA-21( miR-21) 和microRNA-32( miR-32)在多发性骨髓瘤( MM) 骨髓单个核细胞中的表达水平及意义。方法选取2010年1月至2014年1月在我院血液科及骨科就诊的多发性骨髓瘤患者46 例和正常对照的骨髓标本30例作为研究对象，患者均符合多发性骨髓瘤的诊断标准，采用实时荧光定量PCR法检测骨髓单个核细胞中miR-21和miR-32的表达水平。结果miR-21和miR-32 在MM 中的表达水平明显高于正常对照组，难治组miR-21和miR-32 表达水平明显高于初治组，差异均有统计学意义(P<0.05) 。治疗缓解组miR-21和mR-32 的表达水平低于初治组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miR-21和miR-32 的表达可以对MM患者疾病进展和预后进行预测。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1123)

多发性骨髓瘤(MM)为一种发病率较高的血液系统恶性肿瘤性疾病，其最主要病理特征是骨髓中出现能够无限增殖的异常的浆细胞[1]，并进一步导致相关组织和器官损伤。其在血液系统肿瘤中约占10%-15%，位居第二位[2]。对于多发性骨髓瘤的发病机制很多是针对编码蛋白的基因开展的研究，近年来，学者对于非编码微小RNA(microRNA，miRNA)的研究逐渐增多，这对于研究多发性骨髓瘤的发病机制，提高该病的治疗效果，进行疾病的预后研究都具有一定的意义。本研究采用荧光定量RT-PCR方法检测miR-2l和miR-32在多发性骨髓瘤患者和对照组患者的骨髓液中的表达量，以便进一步研究miRNA在多发性骨髓瘤的发病中的作用和意义。

1资料与方法

1.1　研究对象

选取2010年1月至2014年1月在我院血液科和骨科确诊的老年多发性骨髓瘤患者46名作为研究对象，诊断标准参照第三版《血液病诊断及疗效标准》中关于多发性骨髓瘤的判定指标[3]进行，排除标准为：近期患有严重感染性疾病患者、伴有自身免疫性疾病、严重的脏器功能障碍者、以及同时患有其他恶性肿瘤者。病例组共46例，其中男性 28 例，女性18例，年龄35-81 岁，平均(58.9±10.4) 岁，按照EMBT 标准对患者的缓解情况分组，其中初治组16例(16/46，34.8%)，缓解组13例(13/46，28.2%)，难治组17例(17/46，37.0%)；按照临床D-S分期标准对MM患者进行分组：Ⅰ期4例(4/46，8.7%)，Ⅱ期17例(17/46，37.0%)，Ⅲ期25例(25/46，54.3%)；对照组选择骨髓像正常的门诊其他疾病患者30例，男性 18 例，女性12例，年龄37-78 岁，平均( 57.8±9.8) 岁。

1.2　仪器与试剂

北京市六一仪器厂DYZ-22A型电泳仪、美国ABI公司 IMMAGE 免疫化学分析仪、德国 Heraeus 公司的7600-110 自动生化分析仪、美国Implen公司的核酸与蛋白紫外检测仪、美国ABI公司的ABI7300 实时荧光PCR仪，德国Sigma公司的低温高速离心机，Invitrogen 公司的TRIzol、M-MLV逆转录酶，引物合成由上海生工生物公司完成。

1.3　实验方法

①抽取骨髓液5 ml，使用生理盐水稀释至4倍，缓慢加到4 ml的分离液中离心，得到单个核细胞，以生理盐水洗涤3次，接种于15%牛血清的RPMI1640培养液中，放置于5%二氧化碳、37℃恒温、饱和湿度条件的培养箱中培养。②按照TRIzol试剂说明书要求抽提总RNA，检测RNA溶液吸光度值定量,A260 nm/ A280 nm>1.8时可以进行检测。③加poly(A)尾后，用M-MLV逆转录酶，以dT为引物进行反应，以U6为内参进行实时荧光定量PCR法进行扩增,所有样品做3个复孔。分别进行miR-21和miR-32表达量的检测。

1.4　统计学方法

所得资料采用excel建立数据库，使用SPSS13.0统计软件进行数据分析。数值变量资料使用均数±标准差进行描述，两组间的均数比较使用t检验，多组均数间的比较使用方差分析，组间比较使用q检验，分类变量资料使用相对数指标进行描述，组间比较使用χ2检验，以P≤0.05为有统计学意义。

2结果

2.1　各组患者的一般情况比较

本次研究共选择病例组46例和对照组患者30例，两组患者年龄和性别分布均无统计学差别(P>0.05)(表1)。

表1　病例组和对照组患者的基线情况比较

2.2　各组患者miR-21的表达水平比较

本次研究共46例多发性骨髓瘤患者和30例对照,各组患者miR-21的表达水平如表2所示，4组患者的miR-21的表达有差异，4组的表达水平不完全相等(P<0.001)，进一步进行两两比较发现初治组和难治组的表达均高于对照组(q=9.903P<0.05；q=15.607，P<0.05)，初治组的表达水平也高于缓解组(q=7.937，P<0.05)，缓解组的表达水平低于难治组(q=12.584，P<0.05)，缓解组和对照组差异没有统计学意义(P>0.05)。

表2　各组患者miR-21的表达水平比较

#3组之间两两比较均P<0.05，*与对照组比较P<0.05

2.3　各组患者miR-32的表达水平比较

各组患者miR-32的表达水平如表3所示，4组患者的miR-32的表达有差异(P<0.001)，进一步进行两两比较发现初治组和难治组的表达均高于对照组(q=29.037P<0.05；q=36.950，P<0.05)，初治组的表达水平也高于缓解组(q=22.325，P<0.05)，缓解组的表达水平低于难治组(q=28.673，P<0.05)，缓解组和对照组差异没有统计学意义(P>0.05)。

表3　各组患者miR-32的表达水平比较

#3组之间两两比较均P<0.05，*与对照组比较P<0.05

2.4　不同期别MM患者miR-21和miR-32的表达水平

不同期别MM患者miR-21和miR-32的表达水平如表4所示，不同期别的患者miR-21和miR-32水平均有差异(F=79.02，P<0.001；F=93.16，P<0.001)，miR-21的表达水平在Ⅰ期和Ⅱ期患者的之间有差异(q=3.614，P<0.05)，Ⅰ期和Ⅲ期患者比较有差异(q=12.587，P<0.05)，Ⅱ期和Ⅲ期患者比较有差异(q=15.174，P<0.05)；miR-32的表达水平在Ⅰ期和Ⅲ期患者的之间有差异(q=11.421，P<0.05)，Ⅱ期和Ⅲ期患者比较有差异(q=17.821，P<0.05)；Ⅰ期和Ⅱ期患者比较不能认为有差异(q=0.987，P>0.05)。MM患者miR-21和miR-32的表达水平均是随着期别的进展，表达水平提高。

表4　不同期别MM患者miR-21和miR-32的表达水平

◇3组之间两两比较均P<0.05，与Ⅱ期比较△P<0.05，与Ⅰ期比较☆P<0.05

3讨论

多发性骨髓瘤是造血系统的常见的恶性肿瘤，其发病率高且预后差、发病随年龄增长而增高。由于浆细胞广泛的过度增殖和浸润，并分泌大量免疫球蛋白，导致严重的体液免疫缺陷，进而引起贫血、反复感染难以控制、广泛骨质破坏、神经系统症状以及难以逆转的肾脏损害等一系列临床表现，这些都会使得疾病的预后不良。近年来人口老龄化的加剧等多方面的原因影响，使多发性骨髓瘤发病率呈现逐年增高的趋势，但对该病发病机制的研究进展取得的成果还较少，主要集中在遗传学改变和细胞因子的作用[4]。目前，多发性骨髓瘤的治疗效果个体差异较大，已知的预后评价指标不能很好地体现病情的复杂性，故对疾病发病机制和影响预后的因素的进一步研究可以很好的指导临床的治疗工作。关于微小RNA(miRNA)在该病发病机制中所起的作用的研究为进一步探索该病的发病机制提出了新方向。miRNA可以对肿瘤细胞的促进凋亡和抑制凋亡起到作用。这让我们对于多发性骨髓瘤的发病机制的认识进一步得到提高。

有文献报道[5]，miR-32表达水平的升高在包括多发性骨髓瘤在内的多种肿瘤的发病中发挥着重要的致癌基因的作用，miR-32的水平升高使受损的细胞能够继续存活，进而导致肿瘤的发生和促进肿瘤的进展；也有研究发现[6]，miR-32表达水平的升高以PCAF为靶向基因，PCAF可以起到正向调节抑癌基因p53的作用，所以miR-32的高表达会导致p53的表达降低，故其可促进肿瘤的发展；也有学者认为[7]，miR-32的作用是以凋亡调节蛋白Bim为靶分子的，而Bim在造血细胞自身免疫缺陷和肿瘤的形成过程中起着重要的作用，所以miR-32表达的升高会使得Bim的表达降低，进而导致肿瘤的发生。以上研究结果证实了miR-32在多发性骨髓瘤的发病过程中具有重要作用，但还缺乏miR-32的表达水平在多发性骨髓瘤患者治疗过程中变化。目前关于miR-21的研究很多，发现其在多种恶性肿瘤组织中表达升高[8]。miR-21的过表达与多发性骨髓瘤和白血病等肿瘤的增殖和转移有关。miR-21可以调节SPRY2的表达，而SPRY2基因在部分肿瘤中的表达水平下降，可以使肿瘤细胞MAPK/ERK信号过度活化，故SPRY2被认为是抑制MAPK/ERK信号的癌基因。相关研究显示，miR-21下调SPRY2基因的表达水平在体外环境下能促进多发性骨髓瘤细胞的增殖和转移功能，但相关体内试验有待进一步研究，肿瘤细胞的增殖和转移能力是影响肿瘤恶性程度和预后的重要因素。所以在分子水平研究多发性骨髓瘤的增殖和转移机制、判断疾病的预后对该病的治疗是非常重要的。

本次研究发现多发性骨髓瘤患者的miR-21和miR-32的表达水平均高于正常对照组，这和其他研究结果是一致的[9]。而经化疗治疗后，治疗缓解组MM 患者miR-21和miR-32的表达均有所降低，而难治组的miR-21和miR-32表达明显高于初治组患者，这些结果提示，miR-21和miR-32与多发性骨髓瘤患者的发病有关，其可能在发病的过程中起到重要的致癌基因的作用。而缓解组的表达水平低于难治组则可说明miR-21的表达水平可以反应疾病的预后，高表达的患者对于化疗的效果相对较差，缓解组和对照组差异没有统计学意义，这提示有效的治疗使miR-21的水平向正常水平变化。所以miR-21和miR-32的高表达可能预示着疾病的预后不良，miR-21和miR-32可作为多发性骨髓瘤的预后判断指标使用。本次研究结果同时显示，不同期别的MM患者miR-21和miR-32水平均随着肿瘤期别的发展而升高，这也说明miR-21和miR-32和肿瘤的进展密切相关，可以作为预后判断的参考。

参考文献：

[1]M Eugelhardt,M Kleber,J Udi.Current approaches in multiple myeloma and other cancer-related bone diseases[J].Deutsche mediziuische Wocheuschrift(1946),2012,137(20):1057.

[2]张伟，张岩.硼替佐米治疗多发性骨髓瘤的临床观察[J].中华肿瘤防治杂志,2010,17(17) :1368.

[3]张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京：人民卫生出版社， 2007:232-235.

[4]Larocca A， Cavallo F，Mina R，et al.Current treatment strategies with lenalidomide in multiple myeloma and future perspectives[J].Future Oncol,2012,8(10):1223.

[5]Pichiorri F，De Luca L，Aqeilan RI． MicroRNAs:new players in multiple myeloma[J]．Front Genet， 2011，2:22．

[6]Pichiorri F，Suh SS，Ladetto M，et al.MicroRNAs regulate critical genes associated with multiple myeloma pathogenes[J]．Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(35):12885.

[7]王晓燕，孙丽，邢秀华，等.microRNA-32在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义[J].临床肿瘤学杂志，2014,19(1)：46.

[8]Xu J，Wu C，Che X，et al．Circulating microRNAs，miR-21，miR-122，and miR-223，in patients with hepatocellular carcinoma or chronic hepatitis[J].Mol Carcinog，2011,50:136.

[9]M Eugelhardt，M Kleber，J Udi.Current approaches in multiple myeloma and other cancer-related bone diseases[J].Deutsche mediziuische Wocheuschrift，2012，137 (20)：1057.

关键词：多发性骨髓瘤；miR-21；miR-32

Expression and Clinical value of microRNA-21 and microRNA-32 in multiple myeloma patientsSHENJi-chun,LIYang,LIUXiao-mei,etal.(AffiliatedHospitalofLogisticalCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of micro RNA-21( miR-21) and RNA-32( miR-32) in multiple myeloma( MM) patients，and the relationship of its expression with clinical features．MethodsTo collect patients admitted to our hospital’s hematologic and orthopedic department from January 2010 to January 2014,total 46 MM patients and 30 normal controls.The expression levels of miR-21 and miR-32 in bone marrow mono-nuclear cells of MM patients and normal controls were examined by real-time polymerase chain reaction．ResultsThe expression of miR-21 and miR-32 in MM patients were obviously higher than that in normal control with statistical differences(P<0.05)．The expression of miR-21 and miR-32 in refractory MM patients were obviously higher than that in in normal control with statistical significance(P<0.05)．ConclusionExpression of miR-21 and miR-32 in MM plays an important role in the development and progression of MM，and is possible to become a predictor of disease progression and efficacy in MM．

Key words:multiple myeloma ；miR-21；miR-32

(收稿日期：2014-07-04)

作者简介：沈继春(1968-)，女，硕士研究生，副主任医师，副教授,从事贫血及造血系统恶性疾病的诊断及治疗的临床工作。

文献标识码：A

中图分类号：R739.42

文章编号：1007-4287(2015)07-1123-04