淋巴细胞亚群和调节性T细胞在多发性骨髓瘤患者外周血的表达分析及与预后的关系

高　鹏，王雪野，肖中平，付　堃，孔令环，王雪梅，李凌君，封　韬，韩　梅

(吉林省人民医院 血液科，吉林 长春130021)



淋巴细胞亚群和调节性T细胞在多发性骨髓瘤患者外周血的表达分析及与预后的关系

高鹏，王雪野，肖中平，付堃，孔令环，王雪梅，李凌君，封韬，韩梅*

(吉林省人民医院 血液科，吉林 长春130021)

摘要：目的通过检测多发性骨髓瘤(MM)患者外周血T、B淋巴细胞及调节性T细胞(Tregs)水平，评估MM患者免疫功能状态及与预后的关系。方法测定30例MM患者和20例健康志愿者外周血T、B淋巴细胞及Tregs的百分比，分析MM患者血清β2一微球蛋白(β2-MG)、白蛋白(ALB)、血肌酐(CRE)、血红蛋白(HGB)水平与Tregs的相关性。结果(1)与对照组比较， MM组患者外周血CD3、CD4比例无统计学意义；NK细胞的比例增高， CD4+CD25highCD127low/-T细胞/CD4+T细胞(Tregs)增高，CD19细胞的比例下降，CD8细胞的比例升高，CD4/CD8比值下降，差异有统计学意义 (P<0．05)。(2)MM患者外周血Tregs的比例与β2一MG水平成正相关；与血清白蛋白、血红蛋白、血清肌酐水平无明显相关性。结论MM患者外周血淋巴细胞亚群的异常、CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞的表达增高，可能是MM患者免疫逃逸和免疫缺陷的主要原因，对判断MM预后具有一定的参考价值。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1111)

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是常见于老年人的血液系统恶性肿瘤，疾病进展较慢，浆细胞异常增殖，单克隆免疫球蛋白增生导致机体细胞免疫和体液免疫功能异常。因此，参与免疫应答的淋巴细胞在多发性骨髓瘤的发病中起到了重要作用。调节性T细胞(Treg)是一群具有特殊免疫调节功能的T淋巴细胞亚群，具有负性免疫调节作用，在肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病中发挥了重要作用[1]。本研究采用流式细胞术检测30例MM患者及20例健康志愿者外周血淋巴细胞亚群、Tregs的比例，研究MM患者的免疫功能状态，并分析MM患者血清中β2-MG、ALB、HGB、CRE的水平，以探讨MM患者外周血调节性T细胞与预后的关系。

1材料与方法

1．1　一般资料

以吉林省人民医院血液科2012年1月-2014年6月住院诊治的30例多发性骨髓瘤(MM)患者做为研究组，依据国内诊断标准诊断为MM[2]。男性20例，女性10例，中位年龄66岁(56-78岁)。根据国际ISS标准分期：Ⅱ 期12例，Ⅲ 期18例。依据MM 患者免疫球蛋白进行分型：IgG 型11例、IgA 型14例、IgD 型1例、轻链型4例。20例为健康志愿者作为正常对照组，男性12例，女性8例，中位年龄65岁(51-79岁)。

1.2　主要试剂和仪器

CD4-F1TC/CD8-PE/CD3-PC5抗体，CD3-F1TC/CD(16+56)PE，CD3-F1TC/CD19-PE CD4-F1TC，CD25-PE，CDl27-CY5抗体， OptiLyseC血细胞溶血剂，EPICS XL流式细胞仪为美国贝克曼公司产品。全自动生化分析仪(OLYMPUS，2700，日本)，全自动血细胞分析仪(Sysmex XE2100，日本)。

1．3　实验方法

1．3．1样本的采集所有观察对象均于清晨空腹采取静脉血，分别置于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝管及生化管中备用。

1．3．2细胞染色①100 μl的外周血中加入CD4-F1TC/CD8-PE/CD3-PC5，CD3-F1TC/CD(16+56)PE，CD3-F1TC/CD19-PE抗体各20 μl，混匀后置室温避光孵育15 min。②100 μl的外周血中加入CD4-F1TC，CD25-PE，CDl27-CY5抗体各20 μl，混匀后置室温避光孵育15 min。③加500 μl溶血剂，充分混匀后避光10 min，加适量磷酸盐缓冲液(PBS)，1 500 r/min 离心5 min，弃上清，加500 μl PBS，上机分析。

1．3．3FCM分析应用EPICS XL流式细胞仪进行检测，以EXPO32ADCXL4 Color软件分析结果，在前向散射角(FSC)和侧向散射角(SSC)散点图上选定淋巴细胞群，流式细胞术分析MM患者和正常对照外周血CD3、CD4、CD8、NK、CD19的表达，结果以百分率表示。以CD4设门,分析CD4+细胞上CD25和CD127表达，将CD4+CD25+细胞群荧光强度2倍的细胞群定义为CD4+CD25highT细胞，计算该群细胞在CD4+T细胞上所占的百分比。

1.3.4免疫比浊法检测MM患者血清β2‐MG 浓度 生化管抽取MM患者空腹外周血3 ml，采用全自动生化分析仪(OLYMPUS AU2700 ，日本)运用免疫比浊法检测MM 患者血清β2‐MG 浓度，以mg/L 表示。

1.3.5溴甲酚绿法检测MM患者血清ALB浓度生化管抽取MM患者空腹外周血3 ml，采用全自动生化分析仪(OLYMPUS AU2700，日本)运用溴甲酚绿法检测MM 患者血清ALB 浓度，以g/L表示。

1.3.6肌氨酸氧化酶法检测MM患者血清肌酐水平生化管抽取MM患者空腹外周血3 ml，采用全自动生化分析仪(OLYMPUS 2700 ，日本)运用肌氨酸氧化酶法检测MM患者CRE，以μmol/L 表示。

1.3.7仪器法检测MM患者血红蛋白水平EDTA抗凝管抽取MM患者空腹外周血2 ml，采用全自动血细胞分析仪(Sysmex XE2100，日本)运用仪器法检测MM 患者HGB，以g/L 表示。

1．4　统计学处理

2结果

2．1　MM组和健康对照组外周血T细胞和B细胞检测结果比较

与健康对照组比较，MM组外周血CD3、CD4表达无统计学意义；NK细胞的表达增高，CD4+CD25highCD127low/-T细胞/CD4+T细胞(Tregs)增高，CD19细胞的表达下降，CD8细胞的表达升高，CD4/CD8比值降低，差异有统计学意义 (P<0.05)，见表1。

±s)

△P<0．05，与健康对照组比较。

2．2　MM患者外周血Tregs (CD4+CD25highCD127low/-T细胞/CD4+T细胞)的比例与4项生化指标的相关性分析

MM患者外周血Tregs(CD4+CD25highCD127low/-T细胞/CD4+T细胞)的比例分别与血清中β2-MG、ALB、HGB、CRE水平作相关性分析。结果显示，MM患者外周血Tregs(CD4+CD25highCD127low/-T细胞/CD4+T细胞)的比例与β2-MG浓度(r=0.769 ，P<0．01)成正相关；与血清ALB、HGB、CRE水平无明显相关性，见表2。

表2　MM患者外周血Tregs的比例与生化指标的相关性

3讨论

多发性骨髓瘤(MM)是浆细胞恶性肿瘤，异常免疫球蛋白克隆性增生，正常免疫球蛋白受到抑制，导致免疫功能异常。近年来，随着医学免疫学的飞速发展，对MM患者细胞及体液免疫功能的研究也不断深入。国内外研究者发现MM患者体内免疫系统存在多种缺陷，包括免疫细胞如B细胞、T细胞、NK细胞及DC细胞的数量异常以及功能缺陷，还存在调节性T细胞(Tregs)的异常等[4]。MM的预后因素复杂，包括年龄，浆细胞标记指数，血红蛋白水平，血小板计数，白蛋白、β2-MG、肌酐水平，乳酸脱氢酶，细胞遗传学和分子标记等。血清β2-MG水平能反映骨髓瘤细胞总量，与白蛋白共同构成了国际分期标准(ISS)。MM细胞分泌的单克隆免疫球蛋白导致游离轻链增高，对肾小管上皮细胞造成毒性作用，导致了MM肾脏损害。MM细胞在骨髓腔内浸润，细胞因子水平升高，抑制了正常的红系造血；肾功能异常导致促红细胞生成素生成不足；化疗导致骨髓抑制等多种因素引起多发性骨髓瘤患者出现不同程度的贫血。MM患者免疫功能异常，而调节性T细胞与上述各种生化指标的相关性研究较少，因此本研究进行二者的相关性研究，以探讨调节性T细胞与疾病预后的关系。

参与免疫应答的细胞是免疫细胞，免疫细胞包括固有免疫细胞和特异免疫细胞，特异免疫细胞包括T细胞和B细胞，NK细胞以及树突细胞、白细胞等属于固有免疫细胞。肿瘤患者体内的抗肿瘤免疫应答主要由T细胞发挥作用，调节机体免疫应答和维持免疫稳定，其中CD4+T细胞主要为辅助性T细胞(Th)，是免疫应答中的主要反应细胞；而CD8+T细胞主要由细胞毒性T细胞和抑制性T细胞组成，对靶细胞产生细胞毒作用。CD4/CD8比值可反映机体细胞免疫功能状态。本研究发现，与正常对照组相比，MM患者外周血CD8+T细胞表达明显增高，且CD4+/CD8+比值降低，与Oken报道一致[5]，存在Tregs增高，CD19细胞的表达下降，说明MM患者机体存在细胞免疫及体液免疫的功能紊乱，导致了MM的发病。

NK细胞来源于造血干细胞，其表面标志是CD56，其无需激活即可直接杀伤肿瘤细胞及被感染细胞，具有MHC非限制性。Bernal等[6]研究表明MM患者外周血NK细胞数量增多,但活性降低。Jurisic等[7]的研究证实MM患者NK细胞活性下降与疾病进展及骨髓浆细胞浸润程度关系密切。我们以CD16及CD56为NK细胞的标志，研究表明，MM患者外周血NK细胞比例较对照组增高，与上述报道一致。下一步准备进行NK细胞活性的测定，以评估其在MM发病的免疫机制方面的作用。

B细胞占人外周血淋巴细胞的5%-25%，是抗体产生细胞，通过中和作用、调理作用、激活补体的方式介导体液免疫应答。此外，B细胞可加工提呈可溶性抗原给T细胞，活化的B细胞还可以分泌各种细胞因子调节机体免疫功能、参与造血。本研究结果显示，MM患者体内CD19细胞的表达明显低于正常对照组。说明MM患者机体可能存在体液免疫功能的低下和免疫调节功能的异常。

1995年Sakaguchi[8]等发现在人类和小鼠外周血中CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的5%-10%，是T细胞中的具有免疫调节功能的细胞亚群，具有免疫无能性和免疫抑制两大功能特征[9]。许多研究报道肿瘤患者的Tregs细胞有不同程度的增多[10]，是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。而这群细胞中具有免疫抑制功能的调节性T细胞集中在CD4+CD25highT细胞中。Khattri[11]等发现Treg细胞特异表达转录抑制因子Foxp3。Beyer[12]等证实MM患者CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增多。Liu等[13]研究表明Foxp3高表达和CDl27(IL-7受体)低表达之间存在良好的相关性，因此CD4+CD25highCDl27low/-T细胞也可以反映此Tregs群体。本研究结果显示，MM患者外周血CD4+CD25highCD127low/-T细胞比例明显高于正常对照组，且与血清中β2-MG浓度成正相关。说明MM患者体内存在CD4+CD25+Treg细胞异常扩增，可能是MM免疫逃逸的一个重要机制，可考虑作为判断预后的一个辅助指标。

参考文献：

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[6]Bernal M,Garrido P.Changes in activatory and inhibitory natural killer (NK)receptors may induce progression to multiple myeloma:implications for tumor evasion of T and NK cells[J].Hum Immunol,2009，70(10):854.

[7]Jurisic V,Srdric T,konjevic G,at al.Clinical stage-depanding decrease of NK cell activity in multiple myeloma patients[J].Med Oncal,2007，24:312.

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[13]Liu W，Putnam AL，Xu-Yu Z，et al．CDl27 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+Treg cells[J]．J Exp Med，2006，203(7)：1701．

关键词：多发性骨髓瘤；T淋巴细胞亚群；调节性T细胞

Analysis of T Lymphocyte Subsets and Tregs in Peripheral Blood of Patientswith Multiple Myeloma and its Correlation with Prognostic FactorsGAOPeng，WANGXue-ye，XIAOZhong-ping，etal.(DepartmentofHematology,JilinProvincePeople′sHospital，Changchun130021，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate immune state and analyze its prognostic function of patients with MM by detect the changes of the T lymphocyte subsets,B cells and Tregs in peripheral blood of patients with MM．MethodsThe percentage of T lymphocyte subsets,B cells and Treg cells in peripheral blood of 30 patients with MM and 20 healthy donors was measured．The association of Tregs of the MM patients with β2-MG,serum albumin,serum creatinine,hemoglobin were analyzed.ResultsCompared with the control group，the percentage of CDl9，CD4/CD8 were reduced and the percentage of the CD8，NK，CD4+CD25highCD127low/-T cells/CD4+T cells(Tregs) was elevated in patients with MM(P<0．05)．The Treg cells had positive correlation with the level ofβ2-MG and had negative correlation with the level of serum albumin,hemoglobin,serum creatinine．ConclusionMM Patients have a disorder of lymphocyte subsets and have an abnormal amplification of CD4+CD25highCD127low/-Treg cells，which may be an important mechanism of MM immune deficiency and immune escape.It had certain reference value in judging the prognosis of the patients with MM.

Key words:multiple myeloma；T lymphocyte subsets；Tregs

(收稿日期：2014-08-24)

文献标识码：A

中图分类号：R733.3

文章编号：1007-4287(2015)07-1111-04

*通讯作者

基金项目：吉林省科技厅立项课题(201215201)