大鼠心肌缺血心肌酶学、心肌超微结构的变化及淫羊藿苷的影响



大鼠心肌缺血心肌酶学、心肌超微结构的变化及淫羊藿苷的影响

吕铭洋1，姜微2，崔新明3，敬海峰3，柳明洙1*

(1.延边大学基础医学院，吉林 延吉133000；2.吉林大学中日联谊医院 超声科，吉林 长春130033;

4.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021)

淫羊藿苷( icariin,ICA)是从小檗科植物淫羊藿(Epimedium grandiflorum)茎叶中提取出来的一种8-异戊烯基黄酮醇苷类化合物。淫羊藿具有温阳补肾、强筋键骨、祛风除湿等功效[1]。现代药理学研究证明,淫羊藿苷能有效对抗异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血[2]，可以降低大鼠血清中炎症因子 IL-1β 及心肌组织 TNF-α 的生成和释放，降低心肌组织 MPO 活性和 NF-κB 表达，改善心肌组织的病理变化[3]。本文采用结扎左冠状动脉造成大鼠心肌缺血模型，观察淫羊藿苷在大鼠心肌缺血模型中心功能、电镜及心肌酶学的变化。探讨淫羊藿苷对缺血心肌的保护作用及其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1动物Wistar大鼠，体重210-245 g，雄性，由吉林大学基础医学院动物室。合格证号：SCXK-(吉)2013-0001。

1.1.2药品淫羊藿苷(由吉林大学药学院组合化学与创新药物研究中心提供,含量95%以上,用溶媒溶解后配置成所需浓度);阿托伐他汀钙片由辉瑞制药有限公司生产，批号：H98099。LDH、CK、AST测定试剂盒由中生北控生物科技股份有限公司生产，批号分别为140501、130851、141151。SOD、MDA测定试剂盒由南京建成生物工程研究所生产，批号分别为20140918、 20140920。戊巴比妥钠由北京化学试剂公司提供，批号：060222。TTC由国药集团化学试剂有限公司提供，批号：T8877。无水乙醇由北京化工厂提供，批号：20130822。氯化钠注射液由四平巨能药业有限公司提供，批号：140118。乙醚由天津天泰精细化学品有限公司提供，批号：20140504。

1.1.3仪器 EOS880型半自动血液生化分析仪由意大利生产；电子秤为沈阳龙腾电子称量仪器有限公司产品；离心机(LD25-2)由北京离心机厂生产；UV755B紫外可见分光光度计为上海分析仪器厂提供；SSW型电热恒温水槽由上海博讯实业有限公司生产。BI-2000图像分析系统由成都泰盟科技有限公司生产。PowerLab生理信号实时记录系统由澳大利亚生产。

1.2　方法

淫羊藿苷5.0、10.0、20.0 mg·kg-1各剂量组、阿托伐他汀钙片10.0 mg·kg-1组于手术前一周腹腔注射给药，假手术组、模型组给予等容积的生理盐水，每天腹腔注射给药一次，给药第7天，给药1 h后大鼠在乙醚麻醉下仰位固定于手术台上，连接PowerLab生理信号实时记录系统记录正常心电。胸部去毛，应用75 %酒精消毒皮肤，胸部正中纵向切开皮肤约2 cm，于 3-4 肋间心脏搏动最明显处，用止血钳钝性分离肌层，打开胸腔，拉钩扩胸，打开心包膜，暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心房交界处结扎冠状动脉左前降支，将心脏送回胸腔，并挤出胸腔内血液和气体，迅速关闭胸腔。记录心肌缺血即刻标Ⅱ导联心电图，观测ST段偏移幅度，以ST段抬高0.2 mV定为造模成功。缺血24 h候后以戊巴比妥纳30.0 mg·kg-1腹腔注射麻醉，记录大鼠心肌缺血24 h心电。每组动物腹主动脉取血，处死大鼠，剪下心脏，用生理盐水洗净，剪掉右心室，将心脏顺房室沟从心尖到心基部平行均匀的将心室切成5片(厚度在0.1 cm左右)。将心肌切片放置于1% TTC(pH 7.4)染液中，在37℃恒温水浴中染色3-5 min。通过医学图像分析系统将各组心肌切片以图片形式摄入电脑，经软件系统计算心肌梗死面积和左心室面积，通过公式(心肌梗死面积百分比=未染色心肌面积和/心肌切片总面积和×100%)计算出心肌梗死面积占心肌总面积的百分比。离心，取血清。用EOS880型半自动生化分析仪检测血清AST、CPK、LDH水平。按照试剂盒方法测定血清SOD的活性及MDA含量的变化。取1 mm×1 mm×2 mm大小梗死区心肌组织,经4%戊二醛前固定,1%锇酸后固定,乙醇系列脱水,Epon812包埋,型超薄切片机半薄切片定位后,超薄切片(70 nm),双重电子染色。薄切片,醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色后,在电子显微镜下进行心肌细胞超微结构观察。

2结果

2.1　淫羊藿苷对心肌缺血大鼠ECGS-T段和MIS的影响

与假手术组相比较，模型组梗死面积明显升高(P<0.001)，说明模型成立。淫羊藿苷5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg剂量组及阿托伐他汀钙片组可明显降低心肌梗死面积(P<0.05，P<0.01)。与假手术组相比较，模型组S-T段明显升高(P<0.001)，说明模型成立。淫羊藿苷5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg剂量组及阿托伐他汀钙片组可明显降低S-T段(P<0.05，P<0.01)。结果详见表1。

2.2　淫羊藿苷对心肌缺血大鼠血清AST，CK及LDH的影响

与假手术组相比较，模型组大鼠血清AST、CK、LDH水平均明显升高(P<0.01、P<0.001)，说明模型成立。淫羊藿苷5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg剂量组及阿托伐他汀钙片组可明显降低血清AST的含量(P<0.05)，淫羊藿苷5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg剂量组及阿托伐他汀钙片组可明显降低血清CK的含量(P<0.05、P<0.01)，其他各组无明显作用；淫羊藿苷5.0mg/kg、 10.0mg/kg、20.0mg/kg剂量组及阿托伐他汀钙片组可明显降低血清LDH的含量(P<0.05、P<0.01)，结果见表2。

表1　　心肌缺血大鼠ECGS-T段和心肌梗死面积的

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与假手术组比较，▲▲▲P<0.001

组别剂量(mg·kg-1)AST(UI/L)CK(UI/L)LDH(UI/L)假手术组———132.07±28.87310.69±81.34419.72±99.07模型组———325.34±109.39▲▲▲732.95±158.31▲▲▲980.78±321.49▲▲阿托伐他汀钙片10.0230.89±49.29*596.44±155.12*601.73±256.71*淫羊藿苷5.0241.59±80.61*585.34±95.39*708.10±237.60*10.0192.14±57.05**471.64±203.78**521.92±154.09**20.0218.34±44.29*563.73±180.03*621.55±183.42*

注：与模型组比较，*P<0.05 ,**P<0.01 与假手术组比较，▲▲P<0.01 ，▲▲▲P<0.001

2.3　淫羊藿苷对心肌缺血大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px的影响

与假手术组相比较，模型组血清MDA水平均明显升高(P<0.001)，SOD、GSH-Px活性明显降低(P<0.01)，说明模型成立。淫羊藿苷5.0 mg/kg、10.0 mg/kg、20.0 mg/kg剂量组及阿托伐他汀钙片组可明显降低血清MDA的含量(P<0.05，P<0.01)，各剂量组及阿托伐他汀钙片可明显升高血清SOD及GSH-Px的含量(P<0.05，P<0.01、P<0.001)，结果见表3。

组别剂量(mg·kg-1)MDA(nmol/L)SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)假手术组———5.27±0.87180.69±11.5231.88±8.17模型组———9.77±2.83▲▲▲143.44±16.73▲▲▲19.64±5.57▲▲阿托伐他汀钙片10.07.44±2.27*159.64±17.85*26.49±5.10*淫羊藿苷5.06.91±1.83*164.94±9.75*25.92±3.93*10.05.90±1.37**170.03±9.96***27.16±3.64*20.07.52±2.40*165.99±8.94**26.52±2.49**

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与假手术组比较，▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001

2.4　淫羊藿苷对急性心肌细胞超微结构的影响

假手术组：心肌线粒体包膜完整，嵴排列整体、连续，肌丝结构排列清晰，肌膜排列完整，细胞核清晰可见。模型组：肌丝排列疏松、断裂、紊乱，明暗带模糊不清，线粒体排列紊乱，有空化，核周围细胞质空化，肌膜破损，细胞膜消失。呈凝聚状。阿托伐他汀钙片组：心肌线粒体沿肌丝长轴排列尚规整，线粒体嵴无明显破坏，心肌细胞肌丝排列规整，无明显破坏。

淫羊藿苷5.0 mg·kg-1组：肌丝排列比较整齐，各带较清晰，可见少量肌丝断裂，线粒体仍有嵴断裂，呈凝聚状。淫羊藿苷10.0 mg·kg-1组：肌丝排列比较整齐，各带清晰，可见少量肌丝断裂，线粒体嵴呈凝聚状。淫羊藿苷20.0 mg·kg-1组：肌膜完整，细胞核清晰，心肌细胞肌丝排列整齐，肌节结构清晰可见，线粒体嵴比较清晰。见图1。

图1　淫羊藿苷对心肌缺血大鼠心肌细胞超

3讨论

心电图ST段的变化是心肌缺血最早期出现的、最敏感和确切的指标之一，能够反映心脏的损伤程度。模型组血清 LDH、CK、AST释放增多，心肌梗死范围增大，与电镜下超微结构的观察发现模型组肌膜破损、细胞膜消失、肌丝断裂、线粒体增生肿胀、溶酶体膜破裂、有明显的空泡变性相吻合。通过TTC染色,可将非缺血区染成红色，而缺血区不染色，故可直观的评判心肌缺血程度[4]。本实验结果表明，淫羊藿苷可降低大鼠冠脉结扎所致心肌缺血ST段的抬高，减少心肌细胞中LDH、AST和CK的释放和心肌梗死面积。

心肌缺血时有大量自由基生成，使心肌细胞膜中不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，会加重心肌缺血，增加心肌细胞的凋亡和心肌组织的坏死[5]。 MDA 是评价心肌缺血损伤的较好指标之一。 SOD 和 GSH-Px 是能够清除氧自由基的酶，所以SOD 和 GSH-Px 活性的高低可间接反应机体清除氧自由基的能力。本实验中阿托伐他汀钙片组、淫羊藿苷实验组血清中MDA 含量明显低于模型组，SOD和GSH-Px 的活性明显高于模型组，具体作用就是通过提高 SOD 的活力来对抗氧自由基。

有研究表明，心肌线粒体是细胞清除氧自由基、进行呼吸作用和能量转换的重要场所，是对心肌缺血异常敏感的细胞器，其提供的能量是细胞生命活动的保证，其结构和功能的完整性是反映心肌损伤的敏感性指标[6]。

本实验研究结果表明，与模型组相比，电镜观察显示淫羊藿苷实验组心肌细胞超微结构损伤明显减轻，心肌细胞肌丝排列规则，肌丝明暗带清楚，线粒体肿胀，嵴部分断裂，有空泡，核膜较清晰。表明淫羊藿苷能够保护缺血引起的细胞损伤。

参考文献：

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典( 一部) [M]．北京：中国医药科技出版社，2010:306- 308．

[2]潘志伟，王秋娟，杨涓，等.淫羊藿苷对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血的影响[J]．中国药理学通报，2007，23(5):622.

[3]郭庆军，王桂敏，张秀秀.淫羊藿苷预处理对心肌缺血再灌注损伤炎症反应的影响[J]．中国病理生理杂志，2013,29(11):2034.

[4]周玖瑶，林辉，李锐.环维黄杨星D对心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影响[J]．中药材，2006，29(12):1337.

[5] Murphy E，Steenbergen C.Mechanism underluing acutrprotection from cardiac ischemia-reperfusion injury[J]．Physiol Rev，2008，88:581．

[6]王小燕，景桂霞.黄芪预处理对家兔心肌缺血再灌注后心肌线粒体结构及功能的影响[J].西安交通大学学报(医学版),2008,29(3):329.

(收稿日期：2014-06-25)

文章编号：1007-4287(2015)07-1057-03

*通讯作者